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Beta-Lattamasi in azione |
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Molecola del mese di luglio 2025 I ricercatori sono riusciti a osservare le varie fasi del meccanismo della resistenza batterica agli antibiotici  IntroduzioneCirca il 75% degli antibiotici attualmente in uso sono basati sui beta-lattami, e comprendono penicilline, cefalosporine e carbapenemi, che presentano tutti un caratteristico anello lattamico (cioè un'ammide cliclica) a 4 membri. Questi antibiotici sono efficaci perché assomigliano ai peptidi naturali coinvolti nella formazione del peptido-glicano una struttura a rete che costituisce la parete cellulare dei batteri. Quando gli enzimi che formano la parete cellulare si legano ai farmaci che contengono un beta-lattame, rimangono bloccati e non riescono più a legare i loro normali substrati. Questo impedisce la formazione della parete cellulare e porta infine alla morte del batterio. Tuttavia, molti batteri hanno sviluppato resistenza contro questi farmaci: hanno imparato a produrre una famiglia di proteine chiamate beta-lattamasi, che si legano all'anello beta-lattamico del farmaco e lo aprono, rendendo inefficaci gli antibiotici. Qui a fianco è mostrata la beta-lattamasi di Mycobacterium tuberculosis (BlaC) che forma un tetramero. Osservare i dettagli su scala atomica delle reazioni mentre avvengono Per progettare farmaci migliori, è essenziale capire nel dettaglio come funzionano le beta-lattamasi. Questo tuttavia è difficile, perché la reazione di scissione dell'anello beta-lattamico avviene molto rapidamente e non si può osservare utilizzando tecniche strutturali standard. Nella cristallografia tradizionale a raggi X, infatti, le proteine cristallizzate sono esposte a fasci di raggi X per registrare un pattern di diffrazione, che può essere utilizzato per determinare le strutture molecolari. Questi raggi X sono continui e di bassa intensità, e quindi il cristallo deve essere esposto al fascio di raggi X per un periodo di tempo prolungato mentre i dati vengono raccolti. Un tempo troppo lungo rispetto ai tempi delle reazioni. Una tecnica più recente, la cristallografia seriale a femtosecondi (SFX), utilizza laser a raggi X a elettroni liberi (XFEL) per fornire impulsi di raggi X molto brevi e intensi ai campioni, catturando i pattern di diffrazione appena prima che i campioni vengano distrutti. Con la tecnica SFX si usano cristalli molto piccoli, che consentono ai ricercatori di introdurre rapidamente piccole molecole (come gli antibiotici) nei cristalli proteici in miscelatori diffusivi appositamente progettati. Queste molecole possono quindi diffondere nei cristalli proteici e innescare la reazione. Usando questo nuovo metodo, chiamato mix-and-inject-serial-crystallography (MISC), una reazione può essere osservata ad alta risoluzione iniettando la miscela di cristalli nel fascio XFEL in diversi momenti dopo la miscelazione. Resistenza agli antibiotici in azione Nel 2018, i ricercatori hanno progettato un esperimento MISC per osservare in dettaglio l'azione di una beta-lattamasi usando una sorgente XFEL. In questo esperimento, minuscoli cristalli proteici della beta-lattamasi BlaC di Mycobacterium tuberculosis sono stati miscelati con l'antibiotico ceftriaxone poco prima dell'esposizione agli impulsi di raggi X. I dati raccolti a 30 millisecondi, 100 millisecondi, 500 millisecondi e 2 secondi dopo la miscelazione hanno rivelato che la reazione di scissione dell'anello beta-lattamico avviene principalmente tra i 100 e i 500 millisecondi. Nei tre riquadri qui sopra sulla destra sono mostrati tre momenti della reazione. Nel primo, ottenuto prima del mescolamento, si vede l'enzima prima dell'arrivo dell'antibiotico (file PDB 6B5X) e notiamo che vicino alla serina vi è un gruppo fosfato. Nel secondo, ottenuto dopo 100 millisecondi, si vede che la reazione comincia con la formazione di un complesso non-covalente tra enzima e antibiotico (file PDB 6B68). A questo punto si realizza l'attacco nucleofilo da parte della serina 70 della beta-lattamasi, che apre l'anello beta-lattamico e si lega covalentemente formando un estere intermedio. Nel terzo riquadro, ottenuto dopo 500 ms, si vede che l'estere è stato idrolizzato rilasciando la serina e l'antibiotico disattivato (file PDB 6B69). Entro 2 secondi, l'enzima ha già legato un nuovo antibiotico, quello che era legato appena a fianco (mostrato in viola). È interessante notare che solo due subunità (mostrate in azzurro) hanno catalizzato la reazione di scissione durante il corso dell'esperimento. Osservare l'azione degli inibitori La cristallografia seriale mix-and-inject (MISC) è stata utilizzata anche per studiare l'inibizione delle beta-lattamasi da parte di inibitori chiamati a substrato suicida, che si legano irreversibilmente alle beta-lattamasi e ne bloccano l'attività. Qui sotto è mostrato il processo di inibizione di BlaC da parte di uno di questi farmaci, chiamato sulbactam (giallo). 
Il processo di inibizione inizia con la formazione di un complesso enzima-inibitore non covalente nel sito attivo (30 ms, file PDB 8EBR). Come accade anche con il ceftriaxone (visto prima), dopo questa fase vi è l'attacco nucleofilo da parte della serina 70 cataliticamente attiva. In questo caso, tuttavia, si forma un estere intermedio acil-enzima più stabile che tiene legata la serina e rende l'enzima inattivo (240 ms, file PDB 8EC4). Il sulbactam, che è di dimensioni inferiori rispetto agli antibiotici come la ceftriaxone, è stato osservato nel sito attivo di tutte e quattro le subunità di BlaC. Nelle due subunità azzurre, tuttavia, la reazione avviene così rapidamente che non è stato osservato un substrato sulbactam pre-catalizzato. Nelle subunità blu scuro, la reazione è proceduta abbastanza lentamente da consentire ai ricercatori di osservare il legame del sulbactam prima della catalisi. Il sulbactam e inibitori simili sono stati approvati dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti per l'uso in combinazioni a dose fissa con antibiotici beta-lattamici precedentemente approvati (ad es. sulbactam più ampicillina, noto come unasyn). Esplorando la Struttura - Beta-Lattamasi in azione . . . . . . .  In questa serie di istantanee scattate in diversi momenti, il legame di un antibiotico (ceftriaxone) e la successiva scissione dell'anello beta-lattamico sono stati osservati a risoluzione atomica. La serina catalitica dell'enzima è mostrata in giallo. In magenta è mostrato l'antibiotico che subisce la reazione e viene inattivato. Nell'immagine centrale vediamo che il suo anello beta-lattamico (quadrato) e ancora intatto. Nell'immagine di destra l'anello è estato aperto e l'antibiotico è diventato inattivo. In viola è mostrata la seconda molecola di antibiotico che è in posizione per legarsi al sito attivo una volta che questo è vuoto. Argomenti per ulteriori esporazioni Scopri una diversa beta-lattamasi, la New Delhi Metallo-beta-lattamasi (mdm 7/2025). Leggi di più sui superbatteri e la resistenza agli antibiotici. Antibiotici diversi hanno modi diversi di attaccare i microbi. Molti antibiotici attaccano le pareti cellulari del batterio, come la penicillina (mdm 5/2002) e la vancomicina (mdm 12/2025). Alcuni antimicotici, come l'actinomicina (mdm 4/2013), bersagliano il DNA. Le tecniche di cristallografia risolta nel tempo sono state utilizzate anche per catturare proteine attivabili dalla luce, come la proteina gialla fotoattiva (mdm 3/2017).  Bibliografia6B5X, 6B68, 6B69: Olmos JL Jr, Pandey S, Martin-Garcia JM, Calvey G, Katz A, Knoska J, Kupitz C, Hunter MS, Liang M, Oberthuer D, Yefanov O, Wiedorn M, Heyman M, Holl M, Pande K, Barty A, Miller MD, Stern S, Roy-Chowdhury S, Coe J, Nagaratnam N, Zook J, Verburgt J, Norwood T, Poudyal I, Xu D, Koglin J, Seaberg MH, Zhao Y, Bajt S, Grant T, Mariani V, Nelson G, Subramanian G, Bae E, Fromme R, Fung R, Schwander P, Frank M, White TA, Weierstall U, Zatsepin N, Spence J, Fromme P, Chapman HN, Pollack L, Tremblay L, Ourmazd A, Phillips GN Jr, Schmidt M. (https://www.google.com/search?q=2018) Enzyme intermediates captured "on the fly" by mix-and-inject serial crystallography. BMC Biol 16, 59. 8EBI, 8EBR, 8EC4: Malla TN, Zielinski K, Aldama L, Bajt S, Feliz D, Hayes B, Hunter M, Kupitz C, Lisova S, Knoska J, Martin-Garcia JM, Mariani V, Pandey S, Poudyal I, Sierra RG, Tolstikova A, Yefanov O, Yoon CH, Ourmazd A, Fromme P, Schwander P, Barty A, Chapman HN, Stojkovic EA, Batyuk A, Boutet S, Phillips GN Jr, Pollack L, Schmidt M. (2023) Heterogeneity in M. tuberculosis ß-lactamase inhibition by Sulbactam. Nat Commun 14, 5507. Calvey GD, Katz AM, Schaffer CB, Pollack L. Mixing injector enables time-resolved crystallography with high hit rate at X-ray free electron lasers. Struct Dyn. 2016 Aug 29;3(5):054301. Wiedorn, M.O., Oberthür, D., Bean, R. et al. cite_start Megahertz serial crystallography. Nat Commun 9, 4025.
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