Molecola del Mese
di David S. Goodsell
trad di Mauro Tonellato

Enzimi Glicolitici


Molecola del Mese di Febbraio 2004

Introduzione
Il glucosio dà energia a tutte le nostre cellule. E' una molecola combustibile conveniente perché è stabile e solubile, quindi facile da trasportare attraverso il sangue. Il glucosio viene immagazzinato nel fegato sotto forma di glicogeno e da qui viene trasportato in tutte le cellule che lo possono utilizzare rapidamente per ricavarne energia. Il glucosio può essere bruciato all'aria in una provetta formando anidride carbonica, acqua, luce e calore. Anche le nostre cellule bruciano glucosio, ma lo fanno in una serie di tappe piccole e ben controllate, così possono catturare l'energia della reazione in una forma più facilmente utilizzabile, come ATP (adenosina trifosfato). La glicolisi (scissione dello zucchero) è il primo processo nella combustione cellulare del glucosio.

La Scissione del Glucosio
La glicolisi sottopone una molecola di glucosio ad una serie di dieci trasformazioni chimiche in sequenza che alla fine producono due molecole di acido piruvico, 2 ATP e 2 NADH (nicotinamide adenina dinucleotide in forma ridotta) secondo la seguente reazione semplificata:

Durante questo processo, il glucosio dapprima viene legato a due fosfati (consumando due molecole di ATP), poi è tagliato in due frammenti, e infine isomerizzato e disidratato. Si ottengono così due molecole di acido piruvico e vengono liberate quattro molecole di ATP. In totale, la glicolisi produce due molecole di ATP nuove usando l'energia di questa demolizione parziale del glucosio. L'ATP viene usato per dare energia ai processi molecolari in tutta la cellula. Inoltre, una delle reazioni della glicolisi estrae anche due ioni idruro (ioni idrogeno negativi) dalle molecole di zucchero, sotto forma di due NADH, che possono essere usati per riduzioni biochimiche o per creare nuova energia chimica.

Dopo la Glicolisi
Il sesto enzima della glicolisi rimuove uno ione idruro dallo zucchero, trasferendolo ad una molecola trasportatrice di idruro, il NAD+ (nicotinamide adenina dinucleotide) che viene trasformato in NADH. Se la cellula non mettesse in moto altre reazioni in grado di riconvertire il NADH in NAD+, questo sarebbe subito esaurito e la glicolisi si fermerebbe all'istante. Le cellule hanno sviluppato molti modi diversi per ossidare il NADH in NAD+:
1) Molte cellule, inclusa la maggior parte delle nostre, fanno reagire il NADH con l'ossigeno O
2 per formare acqua, producedo così molto ATP attraverso una serie di reazioni chiamate catena respiratoria e fosforilazione ossidativa (si veda la Molecola del mese Citocromo C Ossidasi). Questo processo è noto come respirazione cellulare.
2) Le cellule di lievito usano un altro enzima (si veda la Molecola del mese Alcol Deidrogenasi) per trasferire gli ioni idruro dal NADH ai frammenti stessi prodotti dalla glicolisi. Così l'acido piruvico prima perde CO2 formando acetaldeide, questa viene poi ridotta dal NADH formando alcol etilico che è espulso dalla cellula. Ogni volta che beviamo una birra o un bicchiere di vino, beviamo alcol prodotto attraverso questo processo, conosciuto come fermentazione alcolica.
3) I muscoli sotto sforzo intenso che si stanno contraendo troppo velocemente non riescono ad avere dal sangue abbastanza ossigeno per continuare la loro azione, quindi trasferiscono lo ione idruro dal NADH all'acido piruvico, il prodotto finale dalla glicolisi, per formare acido lattico. Questo processo è noto come fermentazione lattica. Durante un'intensa attività anaerobica, l'acido lattico si accumula nei muscoli, e li obbliga al riposo. Così l'acido lattico può essere eliminato e riconvertito in glucosio quando l'ossigeno diviene ancora disponibile.

I Magnifici Dieci
La glicolisi è un processo estremamente affascinante che si realizza in dieci tappe ognuna governata da un enzima diverso. Questi enzimi si sono perfezionati nel corso dell'evoluzione per realizzare rapidamente ed efficientemente i loro diversi compiti chimici: aggiungere, rimuovere, e spostare atomi senza commettere errori. Il processo è attentamente regolato, così il glucosio viene degradato solamente quando c'è bisogno di energia. Nella glicolisi, si trovano esempi di enzimi allosterici che cambiano forma durante il loro funzionamento; enzimi che formano legami covalenti con i loro substrati durante la reazione; ed enzimi che usano ioni metallici o molecole organiche per completare la propria azione. Alcuni di questi enzimi sono così efficienti che lavorano più velocemente del ritmo con il quale le molecole di zucchero possono arrivare a loro. L'intero processo è sottoposto a regolazione enzimatica così che ogni passo procede facilmente, ma non in modo incontrollato, verso l'obbiettivo di catturare l'energia della demolizione ossidativa del glucosio.

Tappa 1: Esochinasi

La esochinasi compie il primo passo della glicolisi, usando una molecola di ATP per avviare il processo. Trasferisce un gruppo fosfato dall'ATP al glucosio, formando glucosio-6-fosfato. Daniel Koshland comprese, dieci anni prima che la struttura della esochinasi fosse nota, che questa reazione chimica deve avvenire lontano dall'acqua, per impedire che al posto del glucosio sia una molecola d'acqua a staccare il fosfato dall'ATP. Quindi egli propose che la esochinasi compia un adattamento indotto, chiudendosi intorno all'ATP e al glucosio dopo che questi si sono legati nel sito attivo. Quando molte strutture di esochinasi di lievito sono state risolte negli anni '70, si è potuto dimostrare che la sua intuizione era corretta. La esochinasi ha la forma di un morsetto, con un grande incavo su un lato (mostrato qui a fianco con una freccia). La struttura senza glucosio, mostrata sulla sinistra (file PDB 2yhx) è aperta e permette al glucosio di entrare nel sito attivo. Ma quando questo si è legato, come mostrato sulla destra (file PDB 1hkg) la struttura si chiude, circondando la molecola di glucosio. Queste due strutture sono state risolte prima che la sequenza di amminoacidi fosse del tutto nota, così sono incomplete. Per osservare un enzima più completo, si veda il file PDB 1ig8 per la forma aperta, e il file PDB 1bdg per la forma con il glucosio legato.

Come accade spesso, quando si considera il modello umano, le cose diventano più complicate. Nell'uomo vi sono molti tipi di esochinasi, per soddisfare le necessità lievemente diverse di vari tipi di cellule. L'enzima illustrato qui a destra è preso da cellule di cervello (file PDB 1dgk). È due volte più grande della esochinasi di lievito, ma la cosa straordinaria è che è costruito da due subunità che assomigliano a due enzimi di lievito legati testa-a-coda. Le due metà hanno un sito attivo quasi identico. Quella inferiore è specializzata nella reazione catalitica, mentre quella superiore è specializzata nella regolazione e non sa compiere la reazione di trasferimento del fosfato.

 





















Tappa 2: Fosfoglucosio Isomerasi












La seconda tappa della glicolisi è una isomerizzazione: una reazione che cambia la forma di una molecola, senza aggiungere o rimuovere atomi. L'enzima fosfoglucosio isomerasi, mostrato qui a fianco (file PDB 1hox) prende il glucosio-6-fosfato e scambia di posto alcuni atomi, formando fruttosio-6-fosfato (giallo). L'enzima può far procedere questa reazione in entrambe le direzioni. Quindi, quando il glucosio-6-fosfato è abbondante nella cellula, lo converte in fruttosio-6-fosfato, mentre quando è più comune il fruttosio-6-fosfato, l'enzima compie la reazione inversa e lo riconverte in glucosio-6-fosfato.

I ricercatori hanno scoperto da poco che questa proteina svolge anche altri ruoli fuori dalla cellula, dove non si comporta come un enzima, ma piuttosto come un messaggero molecolare. Viene prodotto dai globuli bianchi del sangue e contribuisce al controllo della crescita e del movimento di molti tipi di cellule. Indagando sempre più in profondità nel genoma umano, i ricercatori continuano a scoprire numerosi esempi di altre proteine dalla doppia personalità che hanno una funzione in un luogo nel corpo ed una funzione completamente diversa da qualche altra parte.


Tappa 3: Fosfofruttochinasi

La terza tappa costituisce il punto principale di regolazione della glicolisi. Il glucosio-6-fosfato e il fruttosio-6-fosfato, formati nelle prime due tappe della glicolisi, possono essere usati anche da altri processi cellulari. Ma quando la fosfofruttochinasi aggiunge un secondo fosfato allo zucchero, questo è destinato ad essere spezzato in frammenti. La fosfofruttochinasi è come un piccolo computer molecolare che sente i livelli di molecole diverse e decide se è il momento giusto per rompere lo zucchero. Per esempio, quando sono alti i livelli di ADP ed AMP, la cellula ha bisogno di sintetizzare ATP, e così l'enzima si attiva. L'enzima batterico mostrato sulla destra (file PDB 4pfk) è composto di quattro subunità identiche. Gli enzimi presenti nelle cellule umane sono anche più grandi e più complessi. Il sito attivo lega lo zucchero (giallo) ed un ATP (rosso, in realtà in questa struttura è legato ADP, insieme ad un ione magnesio, verde). Notate che i due siti di legame per lo zucchero sono composti da due subunità diverse, che si avvicinano ad entrambi i lati della molecola. L'enzima ha anche siti di legame regolatori sia in alto che in basso. In questi sono legate altre molecole di ADP, segnate con asterischi.
La fosfofruttochinasi realizza la sua azione grazie al fatto che le sue subunità sono mobili.
Come è mostrato qui sotto, in una vista di lato della molecola, tutto l'enzima si deforma quando l'ADP si lega ai siti regolatori. La forma attiva dell'enzima è mostrata sulla sinistra (file PDB 4pfk) mentre quella inattiva è mostrata a destra (file PDB 6pfk). Quando l'enzima si flette (come indicato dalle frecce), la forma del sito attivo cambia e l'enzima diventa attivo o inattivo.



Tappa 4: Fruttosio-1,6-difosfato Aldolasi

A questo punto della glicolisi, la molecola di zucchero è attivata e la cellula è pronta per tagliarla. Il quarto enzima, fruttosio-1,6-difosfato aldolasi, taglia la molecola nel mezzo, producendo due pezzi simili, ognuno con un solo fosfato legato. L'enzima può realizzare anche la reazione inversa, legando insieme queste due molecole più piccole per riformare il fruttosio-1,6-difosfato. Anzi, l'enzima prende il nome da questa reazione inversa che è una condensazione aldolica. L'enzima mostrato qui (file PDB 4ald) si trova nelle nostre cellule muscolari. Contiene quattro subunità identiche, ognuna col suo proprio sito attivo.















Il sito attivo usa una speciale lisina (Lys 229) per attaccare la catena di zucchero. Come mostrato qui a destra (file PDB 1j4e) questa lisina forma un legame covalente con la molecola durante la reazione di scissione. Questa struttura è congelata in uno stadio in cui la molecola di zucchero (ossigeno rosso, carbonio bianco, fosforo giallo) è stato tagliata e ne è rimasta solo metà nel sito attivo.

L'enzima aldolasi usato dalla maggior parte dei batteri è diverso dall'aldolasi che abbiamo nelle nostre cellule. Usa due ioni zinco invece di un amminoacido lisina. Potete vedere un esempio di una aldolasi batterica nel file PDB 1zen. Contiene una particolare struttura cilindrica a "barile beta" discussa meglio nella prossima pagina.

Infine date un'occhiata allo strano enzima prodotto dagli archeobactteri delle sorgenti calde (file PDB 1ojx) Usa una lisina nel sito attivo, come il nostro enzima, ma è composto di dieci catene che formano un complesso molecolare enorme.








Tappa 5: Trioso Fosfato Isomerasi

A questo punto della glicolisi, la cellula ha rotto lo zucchero in due frammenti diversi. Per economia, l'ideale sarebbe procedere lungo un solo sentiero, invece che lungo percorsi separati per ognuno dei due pezzi. La quinta tappa della glicolisi rende questo possibile interconvertendo i due pezzi uno nell'altro. La trioso fosfato isomerasi, mostrata qui a destra (file PDB 2ypi) strappa un H+ ad un atomo di carbonio e lo sostituisce su un atomo di carbonio vicino. Un particolare amminoacido glutammato, mostrato nella figura fatta con RasMol a destra in basso compie il trasferimento. La trioso fosfato isomerasi è stata descritta come un enzima perfetto. Compie il suo lavoro miliardi di volte più velocemente rispetto alla reazione non catalizzata. È così veloce che la velocità di reazione è determinata da quanto velocemente le molecole possono arrivare all'enzima .

Per osservare direttamente questa struttura, scaricate il file PDB 2ypi, decomprimetelo e apritelo con Chime o con Chimera (per un aiuto cliccate qui). Osservate che il sito attivo è nel mezzo di un "barile beta" una struttura di forma cilindrica di catene beta.
Questa struttura è visibile nella figura qui a destra dove le catene sono colorate in verde.
Il barile beta è illustrato anche nelle due figure qui sotto, dove si vede un cilindro interno di catene beta circondato da un anello esterno di alfa eliche. Nella figura qui sotto a destra, ottenuta con Chimera, le catene beta sono gialle, mentre le catene ad alfa elica sono rosse. Notate come ogni alfa elica connette due catene beta vicine nel barile.
Provate ad eplorare le strutture dei dieci enzimi glicolitici, noterete che molti altri enzimi possiedono una struttura con questo bel modello di ripiegamento a barile beta.







Tappa 6: Gliceraldeide-3-fosfato Deidrogenasi

Ora che la glicolisi è giunta a metà strada, si può finalmente ricavare dell'energia. Nella sesta tappa, la cellula raggiunge questo scopo sfruttando il fatto che le aldeidi sono molto facilmente ossidabili ad acidi. Per ossidare la gliceraldeide-3-fosfato ad acido 3-fosfoglicerico utilizza un ossidante più forte del necessario, il NAD+, (magenta) che prende su di sè uno ione idruro (idrogeno negativo) diventando NADH. La cosa notevole è che l'eccesso di energia liberato in questa reazione non va perduto, ma viene recuperato legando all'acido glicerico uno ione fosfato inorganico che poi, nella tappa numero 7, verrà trasferito all'ADP per sintetizzare ATP. A questo punto, il NADH può essere usato o per creare altra energia reagendo con O2 (respirazione cellulare) o per ridurre gli stessi frammenti della molecola di glucosio prodotti dalla glicolisi (fermentazione). In tutti e due i casi si ottiene un risultato importante anche dal punto di vista chimico: il NADH torna nella sua forma ossidata NAD+ e diventa ancora capace di ossidare la gliceraldeide 3-fosfato nella tappa numero 6.
La gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi è composta da quattro subunità identiche. Molte delle strutture di questo enzima, come la forma umana illustrata qui sopra sulla sinistra (file PDB 3gpd) hanno il NAD
+ legato in tutti e quattro i siti attivi, insieme con due ioni fosfato. Un ione è legato nel sito che dovrebbe ospitare il gruppo fosfato appartenente alla molecola di zucchero, e si pensa che l'altro sia legato nel sito che posiziona lo ione fosfato inorganico entrante per la reazione.
La figura qui sopra a destra (file PDB 1nqo) mostra la prima parte della reazione, quando la molecola di substrato si è appena legata. Un amminoacido cisteina lì vicino attacca poi la molecola, formando un legame con il carbonio aldeidico. Questo carbonio viene poi ossidato dal NAD
+ formando un tioestere molto reattivo che in seguito si rompe reagendo con uno ione fosfato inorganico (non mostrato in 1nqo). In questa struttura, la cisteina è stata sostituita con una serina, meno attiva, per permettere lo studio. Una istidina lì vicino assiste la reazione.

Tappa 7: Fosfoglicerato Chinasi

Ora, nella settima tappa della glicolisi, la cellula è pronta a sintetizzare ATP. Per ogni glucosio degradato abbiamo ottenuto due molecole di acido 1,3-difosfoglicerico. La fosfoglicerato chinasi prende queste molecole e trasferisce all'ADP il fosfato presente sul carbossile, formando una molecola di ATP. Come col primo enzima della glicolisi, questo processo deve avvenire lontano dall'acqua per assicurare che il fosfato sia trasferito correttamente. La fosfoglicerato chinasi usa lo stesso approccio utilizzato dalla esochinasi: fa avvenire la reazione in uno spazio chiuso situato all'interno dell'enzima, al riparo dalle molecole di acqua che potrebbero interferire. L'enzima è composto di due lobi uniti da un collegamento flessibile. Il lobo superiore si lega all'ADP mentre quello inferiore ha una tasca per l'acido 1,3-difosfoglicerico. L'enzima poi si chiude strettamente e compie il trasferimento del fosfato. La struttura mostrata qui a lato sulla sinistra (file PDB 3pgk) è nella forma aperta con l'ADP legato, mentre la struttura mostrata sulla destra (file PDB 1vpe) è nella forma chiusa.



Tappa 8: Fosfoglicerato Mutasi

Il guadagno di ATP nelle prime 7 tappe della glicolisi è stato zero. Infatti, nelle tappe 1 e 3 si sono consumati 2 ATP e nella tappa numero 7 si sono guadagnati 2 ATP. Nelle tre tappe che restano per concludere il processo è indispensabile produrre altri ATP altrimenti tutta la glicolisi perde di significato.
In effetti nelle utime tre tappe si producono 2 ATP trasferendo all'ADP il fosfato rimasto sull'acido 3-fosfoglicerico. Questa reazione però non può essere realizzata in modo diretto perchè l'energia ottenuta dalla semplice idrolisi di un estere fosforico non è sufficiente a produrre una molecola ricca di energia come l'ATP. La strategia quindi è quella di creare nella molecola una situazione di instabilità, l'enolo dell'acido fosfoenolpiruvico che trasformandosi nella forma chetonica più stabile darà la spinta decisiva per sintetizzare ATP nella tappa 10.

La fosfoglicerato mutasi realizza la prima delle trasformazioni necessarie per produrre ATP: sposta il fosfato dalla fine della molecola (sul carbonio 3) al centro sul carbonio 2.
Questo enzima esiste in molte forme: l'enzima del lievito, mostrato in alto a sinistra. (file PDB 3pgk) è composto di quattro subunità identiche. L'enzima umano è simile, ma contiene solamente due subunià. Le piante e molti batteri costruiscono un enzima completamente diverso che usa ioni manganese per la reazione, come mostrato in alto a destra (file PDB 1eqj)

L'enzima nelle nostre cellule usa un amminoacido istidina speciale, come quello mostrato qui a destra in un enzima batterico (file PDB 1e58). Questa istidina estrae il fosfato e lo mette in un luogo diverso nella molecola. In realtà, l'enzima compie queste operazioni alla rovescia: prima mette un fosfato nella molecola, così per qualche istante ce ne sono due legati, poi stacca l'altro. Per fare questo l'enzima deve essere caricato con un'altra molecola di fosfato prima di compiere la sua reazione. Una piccola molecola intermedia l'acido 2,3-difosfoglicerico porta questi fosfati reattivi all'enzima. Dopo che l'enzima si è caricato, rimane attivo per uno o due minuti compiendo senza sosta la sua reazione molte volte prima che il fosfato si stacchi e debba essere sostituito.



Tappa 9: Enolasi

Nella tappa 9 della glicolisi, l'enzima enolasi disidrata l'acido 2-fosfoglicerico per formare l'acido fosfoenolpiruvico. Questo è un enolo, una molecola instabile che nella tappa 10 verrà trasformato in un chetone, più stabile, cedendo il fosfato per formare ATP. Il compito dell'enzima enolasi è relativamente semplice, infatti l'eliminazione di una molecola di acqua dall'acido 2-fosfoglicerico, forma un nuovo doppio legame in posizione coniugata con il carbossile della molecola.
L'enzima enolasi mostrato qui a destra (file PDB 2one) è interessante perchè mostra due fasi di questa reazione, prima e dopo che l'acqua è stata rimossa. L'enzima contiene due siti attivi identici. La struttura cristallina ha congelato uno stato diverso in ognuno dei siti attivi. L'immagine di sinistra mostra la molecola prima che la reazione inizi, mentre quella di destra mostra la molecola dopo che l'acqua è stata rimossa. L'enolasi usa due ioni metallici in questa reazione. Il primo è un ione magnesio (azzurro) che lega la molecola all'enzima, e la tiene nella giusta posizione. Il secondo ione lega la molecola e anche aiuta la catalisi. In questa struttura, è stato trovato uno ione litio in uno dei siti attivi. Una istidina si trova nella posizione ideale per catalizzare la reazione.



Tappa 10: Piruvato Chinasi


Nell'ultima tappa della glicolisi, la cellula finalmente è pronta a realizzare un guadagno netto nella produzione di ATP. L'enzima piruvato chinasi rimuove il gruppo fosfato rimasto sull'acido fosfoenolpiruvico e lo trasferisce all'ADP formando 2 molecole di ATP. L'energia per la sintesi di ATP viene dalla reazione che trasforma l'enolo instabile dell'acido fosfoenolpiruvico, nel corrispondente chetone stabile formando così l'acido piruvico. Come abbiamo visto in precedenza, l'acido piruvuco è il prodotto finale della glicolisi e può subire due destini diversi: o viene bruciato completamente con O
2 formando acqua e CO2 nella respirazione cellulare aerobica, o viene convertito in molecole di scarto come alcol o acido lattico nelle fermentazioni anaerobiche.

La reazione finale della glicolisi è regolata dall'enzima piruvato chinasi, questo assicura che l'ATP venga sintetizzato solamente quando ce n'è bisogno. Come l'emoglobina, questo enzima viene attivato progressivamente all'aumentare dei livelli del suo materiale di partenza. È attivato anche dalla presenza di zuccheri fosforilati che indicano che molte materie prime sono disponibili. Al contrario, è inibito da molecole che sono abbondanti quando la cellula ha abbastanza energia, come ATP e amminoacidi. La piruvato chinasi è un enzima allosterico che sente i livelli di tutte queste molecole e cambia forma a seconda del risultato. È composto di quattro subunità flessibili sistemate a forma di diamante. L'intero complesso si piega quando si legano molecole nei siti di regolazione. Nelle due strutture mostrate qui sopra, i siti attivi si trovano in alto e in basso, mentre i siti regolatori si trovano nella zona centrale.
La struttura batterica mostrata sulla sinistra (file PDB 1e0u) si trova nella forma inattiva.
La struttura di lievito sulla destra, dall'archivio PDB 1a3w, è piegata nella forma attiva dato che possiede molecole di fruttosio 1,6-difosfato legate nei siti regolatori (magenta). I siti attivi contengono un analogo dell'acido fosfoenolpiruvico (giallo) e due ioni metallici, uno ione potassio ed uno ione manganese (verdi) che aiutano la reazione.