Molecola del Mese
di David S. Goodsell
e di Mauro Tonellato

Cascade e CRISPR


Molecola del Mese di Gennaio 2015
Parole chiave: Cas9, Cas3, proteine associate a CRISPR, sistema immunitario adattativo, terapia anti HIV

Introduzione
Gli organismi viventi sono continuamente attaccati dai virus e quindi hanno sviluppato molte armi per difendersi. I batteri e gli archea usano varie strategie. Hanno dei sistemi innati per combattere le aggressioni più comuni. Per esempio possiedono enzimi di restrizione sempre pronti a tagliare il DNA dei virus invasori. Hanno anche un sistema adattativo simile al nostro sistema immunitario che può essere regolato per proteggerli contro i virus che li attaccano. Questo sistema, chiamato CRISPR-Cas, contiene le informazioni di tutte le minacce passate e fornisce le armi per distruggerle in caso di un nuovo attacco.

Archivio delle Infezioni
I batteri usano le sequenze CRISPR, conservate nel loro genoma, per identificare i virus che li attaccano. La sigla sta per "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats," (brevi ripetizioni palindrome raggruppate e spaziate con regolarità) che si riferisce allo strano susseguirsi di sequenze trovato nel DNA CRISPR. E' composto di piccoli tratti di DNA virale ottenuto da frammenti dei virus che hanno attaccato nel passato, separati da una sequenza ripetuta e caratteristica usata per creare l'archivio. La cosa importante è che le nuove sequenze sono aggiunte all'inizio dell'archivio e così, leggendo la sequenza CRISPR, possiamo conoscere la storia dei virus che hanno attaccato la popolazione batterica nel passato.

Sorveglianza Continua
Un sistema di proteina Cas (CRISPR associated proteins) usa questo archivio di informazioni per combattere i virus quando cercano di infettare di nuovo il batterio. Il centro di questo sistema è il grande complesso proteico Cascade. Questo lega un RNA trascritto dalla sequenza CRISPR e cerca nella cellula dei DNA virali complementari, le tracce dell'infezione. Se trova un DNA virale corrispondente, la proteina si apre e mette in azione delle nucleasi per tagliarlo. La struttura mostrata qui a fianco include il complesso di sorveglianza Cascade composto di 6 tipi di proteine diverse (mostrate nei vari toni del blu) insieme con un frammento di RNA trascritto (rosso) (file PDB 4tvx e 4u7u).




Proteine Cas

Il complesso Cascade lavora con un gruppo di proteine per costruire l'archivio CRISPR che poi usa per proteggere i batteri dai virus. In un primo momento, proteine reclutanti come Cas1 e Cas2 (file PDB 4p6i) vengono usate per tagliare i virus durante l'infezione e per archiviare frammenti di lunghezza opportuna nel CRISPR. Questi pezzi sono poi esibiti da Cascade per combattere eventuali infezioni future di quel virus. Se il virus viene individuato, entra in azione Cas3, il demolitore, che prende il DNA virale infettante individuato da Cascade e lo distrugge.
















Cas9 e Nuove Terapie

Tipi diversi di batteri e di archea hanno sviluppato molte variazioni su questo tema di base.
Il complesso Cascade di tipo I esibisce l'RNA ottenuto dal CRISPR e utilizza come demolitore Cas3 per tagliare il DNA virale.
Nel complesso Cascade di tipo III, l'enzima che taglia il DNA virale fa parte del complesso stesso.
I complessi Cascade di tipo II, come Cas9 (file PDB 4un3 e 4oo8) hanno la proteina di sorveglianza e quella demolitrice comprese nella stessa catena proteica.
Il complesso mostrato qui a fianco include l'RNA ottenuto dal CRISPR (rosso) insieme con un pezzo di DNA virale catturato (giallo). Questa molecola è stata usata di recente in una cura sperimentale contro l'infezione latente da HIV. E' stato usato un virus ingegnerizzato per inserire Cas9 e il CRISPR anti-HIV nelle cellule infettate, questo complesso ha poi tagliato a pezzi il DNA virale che vi si era legato.
















Esplorando la Struttura

Il file PDB 4qyz mostra il complesso Cascade in azione. La struttura include la catena di un CRISPR-RNA (rosso) ed un piccolo pezzo di DNA virale (giallo) dopo che è stato svolto e riconosciuto. Questo complesso rivela una struttura sorprendente, ma logica del DNA e del RNA. L'RNA è aperto e stirato all'interno di una lunga tasca curva di Cascade, mentre il DNA virale (giallo) si è legato fianco a fianco invece di formare la normale doppia elica.
Questa immagine è stata ottenuta con Chimera (vedi Chimica al Computer)






























Spunti per ulteriori esplorazioni
1. - Quando leggete articoli sulle sequenze CRISPR, fate attenzione alla terminologia perchè può trarre in inganno. Per esempio il termine "spacer" è usato per i corti pezzi di DNA virale che sono custoditi in CRISPR e "repeat" è usato per riferirsi alle brevi sequenze ripetute che separano i vari pezzi di DNA virale.
2. - Molti di questi grandi complessi CRISPR-Cas sono stati caratterizzati con la microscopia elettronica. Per esempio, per vedere la struttura del complesso di tipo III (che è diverso dai complessi di tipo I e di tipo II) visitate EMDataBank.

Bibliografia

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4p6i: J. K. Nunez, P. J. Kranzusch, J. Noeske, A. V. Wright, C. W. Davies & J. A. Doudna (2014) Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity. Nature Structural & Molecular Biology 21, 528-534.


Codici PDB Correlati
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