Molecola del Mese
di David S. Goodsell
e di Mauro Tonellato

Effettori TAL


Molecola del Mese di Dicembre 2014
Parole chiave: editare il genoma, TALEN, proteina DNA-legante sequenza specifica

Introduzione
La natura è piena di sorprese e talvolta si trovano dei tesori nascosti nei posti più impensati. Qualche anno fa gli scienziati hanno scoperto uno di questi tesori in un batterio che attacca le piante: una proteina modulare che può leggere la sequenza di nucleotidi del DNA. La comprensione del funzionamento di questa proteina ha aperto la strada a tutta una serie di nuove applicazioni in medicina e biotecnologia. Ora siamo in grado di progettare una proteina per leggere ogni sequenza di DNA che ci interessi e quindi possiamo legare la proteina a punti specifici del genoma. Queste proteine sequenza-specifiche vengono usate per creare nuovi strumenti per manipolare il DNA, e forse porteranno alla messa a punto di nuovi metodi per curare le malattie genetiche

Attacchi e Difese
Queste proteine sono chiamate Effettori TAL che è un acronimo di Transcription Activator-Like, effettori simili agli attivatori della trascrizione. Molti tipi di batteri iniettano queste proteine nelle cellule delle piante, qui viaggiano verso il nucleo dove attivano dei geni che rendono la pianta più suscettibile all'infezione. Alcuni tipi di batteri sintetizzano solo pochi effettori TAL mentre altri ne costruiscono e ne iniettano molte decine. Come accade spesso, comunque, alcune piante hanno sviluppato una strategia difensiva e quando vengono infettate con gli effettori TAL, attivano qualche gene specifico di resistenza.

Lettori Modulari del Dna
Gli effettori TAL sono composti di piccoli moduli lunghi circa 34 amminoacidi ripetuti molte volte in sequenza. Ognuno di questi moduli legge un nucleotide quando l'effettore TAL si lega al DNA. La proteina mostrata qui a destra, presa da un batterio che infetta il riso, ha 23 di questi moduli. Questa struttura cristallografica (PDB 3ugm) include solo la porzione che si lega al DNA, ma la proteina intera include anche una porzione che le consente di entrare nel nucleo e un'altra che attiva i geni bersaglio.





TALEN di successo

Anche se sono passati solo pochi anni dalla loro scoperta, i ricercatori hanno già trovato nuovi modi per usare queste proteine capaci di leggere il DNA. Per esempio, con l'ingegneria genetica, hanno creato la nucleasi TALE (TALEN) unendo il dominio in grado di tagliare il DNA della nucleasi FokI (PDB 1fok mostrata qui sopra in verde) ad un capo dell'effettore TAL. La FokI taglia il DNA solo se forma un dimero e quindi TALEN diventa attiva solo quando due unità si legano alle rispettive sequenze bersaglio di DNA contigue, a questo punto la nucleasi taglia entrambe le catene del DNA e quindi può essere usata per mettere fuori uso un gene specifico o anche per inserire un nuovo gene ingegnerizzato sfruttando il naturale meccanismo di riparazione del DNA della cellula. Questo approccio è stato così efficace che i ricercatori stanno applicando queste strategie ad altri tipi di molecole in grado di riconoscere il DNA come le dita di zinco (mdm 3-2007) e CRISPR.




Esplorando la Struttura

Comparando i TAL di batteri diversi i ricercatori hanno scoperto moduli per leggere le 4 basi azotate del DNA e anche per leggere qualche base azotata modificata. Ogni modulo è composto da una piccola sequenza di 2 alfa eliche. Un amminoacido sul bordo più interno del modulo esegue la lettura toccando il bordo del nucleotide del DNA e un amminoacido vicino (non mostrato qui) lo aiuta a posizionarsi correttamente. Il file PDB 3v6t include un effettore TAL ingegnerizzato con 3 tipi di moduli diversi mostrati nell'immagine qui sopra.
Un modulo con acido aspartico, mostrato a destra con grosse sfere grigie e rosse, forma una interazione specifica con la citosina.
Un altro modulo, in centro, contiene un amminoacido più piccolo, glicina, mostrata con una sfera grigia, che rende più favorevole l'interazione con la timina che possiede un gruppo ingombrante metilico.
Il terzo modulo, a sinistra, usa la serina, mostrata con sfere grigie e rosse, per legare adenina.
Ulteriori ricerche hanno scoperto altri moduli per leggere la quarta base, la guanina.
Nelle due immagini qui sotto, invece, si ha una visione d'insieme dell'interazione tra Effettore TAL e DNA.



Spunti per Ulteriori Approfondimenti
Potete vedere la struttura di un effettore TAL ingegnerizzato prima che si leghi al DNA nel file PDB 3v6t. Ognuno dei moduli degli effettori TAL è composto da 2 alfa eliche con una piccola torsione in una che aumenta l'impaccamento tra le due eliche. Cerca di evidenziare tutte le sequenze di questi effettori TAL per evidenziare questa torsione. Ogni modulo include anche una lisina e una glutammina che formano ineterazioni non specifiche con la catena principale del DNA, cercate di indiduarle.

Bibliografia

D. Deng, C. Yan, J. Wu, X. Pan & N. Yan (2014) Revisiting the TALE repeat. Protein Cell 5, 297-306.

E. L. Doyle, B. L. Stoddard, D. F. Voytas & A. J. Bogdanove (2013) TAL effectors: highly adaptable phytobacterial virulence factors and readily engineered DNA-targeting proteins. Trends in Cell Biology 23, 390-398.

T. Gaj, C. A. Gersbach & C. F. Barbas (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology 31, 397-405.

3v6t, 3v6p: D. Deng, C. Yan, X. Pan, M. Mahfouz, J. Wang, J. K. Zhu, Y. Shi & N. Yan (2012) Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors. Science 335, 720-723.

3ugm: A. N. S. Mak, P. Bradley, R. A. Cernadas, A. J. Bogdanove & B. L. Stoddard (2012) The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target. Science 335, 716-719.


Codici PDB Correlati
Vedi le strutture correlate