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Responsabile:
Prof. Mauro Tonellato

 

2^ ESERCITAZIONE CON CHIME

   


1^ Esercitazione Chime

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Molecola del Mese


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Tirosina chinasi
Esaminiamo ora un'altra proteina, la tirosina chinasi che è stata la Molecola del Mese nel luglio 2003.
Potremo vedere che, nella sua struttura, ci sono non solo porzioni ad alfa elica, ma anche beta a pieghe. Anche in questa proteina noteremo una molecola non proteica legata, ANP (5'-Adenil-immido-trifosfato).
Normalmente nella tirosina chinasi è presente ATP per assistere la reazione di fosforilazione, dato che è un donatore di ioni fosfato. In questo caso, per poter cristallizzare la proteina e sottoporla a diffrazione ai raggi x, hanno sostituito ATP con ANP che è simile strutturalmente, ma non può dare la reazione di fosforilazione e così la struttura proteica resta stabile per il tempo necessario ad eseguire l'esame.

Per cominciare, scaricate il file della tirosina chinasi 2src.zip, decomprimetelo per ottenere il file PDB 2src.pdb e collocatelo in una directory che chiamerete Tirosina.
Fate click destro su 2src.pdb e nel menù che compare scegliete Apri con / Internet Explorer. Nella finestra con fondo nero del browser vedrete la struttura 3D della mioglobina rappresenteta con tratti sottili (rappresentazione wireframe, fil di ferro). Ora ridimensionate la finestra di Internet Explorer perchè occupi solo la metà inferiore dello schermo. Nella metà superiore adattate questa finestra che contiene la procedura da seguire passo passo.

Esaminare la proteina

1) Trascinate il mouse premendo il pulsante sinistro per ruotare la proteina

2)
Premendo shift + pulsante sinistro potete ingrandirla o rimpicciolirla

3)
Premendo shift + pulsante destro potete ruotarla attorno all'asse perpendicolare allo schermo

4)
Premendo Ctrl + pulsante destro potete trascinarla sullo schermo
Notate che c'è un piccolo gruppo di atomo rossi e gialli in sequenza. Si tratta del gruppo trifosfato modificato dell'ANP. Provate ad ingrandirlo e a portarlo in primo piano (fig. 1). Se ci cliccate sopra compare la scritta Hetero: ANP 1 in basso. Notate in giallo gli atomi di fosforo, in rosso gli ossigeni, in blu l'azoto. Osservate anche l'anello del ribosio in grigio e rosso e i due anelli dell'adenina in grigio e blu.

5)
Premendo il pulsante destro compare il menù principale. Scegliete Display e tra le opzioni che compaiono scegliete: Cartoons. Ora dal menù scegliete Color - Structure (fig. 2).
Le porzioni ad alfa elica della proteina sono colorate in porpora, e le porzioni beta pieghe in giallo. Notate che le porzioni beta pieghe sono disposte appaiate e antiparallele come si vede dalla punta delle frecce. Osservate la struttura a forcina con la catena proteica ripiegata su se stessa (fig. 3).

6) Ora dal menù scegliete Color - Group. Poi scegliete Select - Hetero - Ligand e poi Display - Spacefill - Van der Waals e ancora Color - CPK. Vedrete la struttura proteica rappresentata con colori diversi per ogni dominio funzionale e le molecole legate alla proteina in evidenza (fig. 4)
Notate in blu e azzurro scuro (a sinistra) i domini di legame che hanno il compito di legare le proteine alle quali la tirosina chinasi deve trasferire un fosfato. Notate in verde e azzurro chiaro (a destra) i domini catalitici che contengono ATP (il legando) la molecola che esegue la fosforilazione. Notate ancora il lungo filamento azzurro scuro che passa in diagonale dal dominio di legame a quello catalitico. Passa proprio all'interno del sito di legame e così impedisce la funzione dell'enzima. Questa infatti è una forma inattiva di titosina chinasi.

7) Per esaminare in dettaglio l'ANP procedete così: scegliete Display - Sticks e poi Select - Protein - Protein e ancora Display - Backbone. Ora ingrandite e portate in primo piano L'ANP (fig. 5).
Si possono vedere molto bene i due anelli della adenina (a sinistra in grigio e azzurro), L'anello del ribosio (al centro in grigio e rosso), la sequenza di gruppi fosfato (a destra in rosso e giallo) interrotta da un atomo di azoto (in azzurro)

8)
Il gruppo ANP è inserito in una tasca apolare che può essere apprezzata così: scegliete Display - Spacefill - Van der Waals e poi Select - Hetero - Ligand e ora Option - Dot surface - Van der Waals (fig. 6).
Notate che gli amminoacidi che costituiscono la tasca e che si avvicinano all'anello aromatico dell'adenina dell'ANP sono apolari o aromatici come la leucina 273, la leucina 393, la valina 281 e la tirosina 340. (per osservarli basta un click del mouse e se ne può leggere il nome in basso). D'altra parte gli amminoacidi vicini ai gruppi fosfato sono basici come lisina 395 e arginina 388.

9)
Osservate infine la coda verde (in alto in fig. 4) che si lega al dominio azzurro scuro. Questo legame è realizzato da una tirosina fosfato della coda (in evidenza in fig. 4 e in fig. 7). Anzi è proprio la fosforilazione di questa tirosina che inattiva l'enzima, infatti la tirosina fosforilata si va a legare al dominio azzurro scuro e così obbliga la proteina ad assumere la forma a palla che osserviamo.
In questa forma risulta inattivo il sito di legame (in blu in fig. 4) perchè è occupato da quel filamento che collega i domini in diagonale.
Per ottenere la figura 7, selezionate Select - Hetero - Ligand e poi Display - Spacefill - Van der Waals infine deselezionate Option - Dot surface - Van der Waals. Ora ruotate la struttura fino a identificare la tirosina fosforilata che tiene bloccata la coda della proteina (fig. 7). Esplorate gli amminoacidi del dominio azzurro scuro in mezzo ai quali si è legato il gruppo fosfato della tirosina. Anche qui, vicino al gruppo fosfato giallo e rosso, troverete alcuni amminoacidi basici e altri acidi.

 


fig. 1

fig. 2

fig. 3

fig. 4

fig. 5

fig. 6

fig. 7





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