Molecola del mese di settembre 2019
I nanodischi consentono di impaccare in modo efficiente un piccolo tratto di membrana per studi sperimentali

Introduzione
I nanodischi e la microscopia crioelettronica stanno rivoluzionando la biologia strutturale. Nuovi sviluppi nella microscopia crioelettronica consentono ai ricercatori di determinare la struttura di macchine molecolari molto più grandi e complesse che in passato. Tra queste, quelle più sofisticate sono le proteine legate alla membrana che sono di per sé difficili da studiare perché sono inserite in un ambiente lipidico. In questo i nanodischi si sono rivelati utili. Sono formati da un sottile disco di lipidi, grande solo quanto basta per ospitare una singola proteina di membrana, tenuto insieme da una cintura proteica. Nella figura qui a lato si vede un ribosoma (rosso e arancione) che sta sintetizzando una proteina (magenta, ancora legata al tRNA in alto, magenta) che viene espulsa in basso attraverso il canale formato dal complesso proteico di secrezione SecYE (verde) che è inserito in un nanodisco di membrana (apolipoproteine in blu, fosfolipidi in bianco e rosso).

Colesterolo buono
I nanodischi sono stati costruiti usando come modello strutture che già esistono in natura.
Il colesterolo e altri lipidi vengono trasportati in tutto il corpo in piccoli globuli circondati e tenuti in forma da speciali proteine chiamate apolipoproteine. Una classe particolare di questi globuli è chiamata HDL (high-density lipoproteins), lipoproteine ad alta densità, dato che contengono una grande percentuale di proteine e quindi sono più dense di altre lipoproteine più ricche di lipidi come le LDL low-density lipoproteins.
Le HDL sono spesso chiamate colesterolo buono perché hanno il compito di trasportare l'eccesso di colesterolo dalla periferia del nostro corpo al fegato dove viene rimosso dal sangue.
Le HDL si sono rivelate buone anche per la scienza perché una di loro ha una forma a disco che è stata di ispirazione per la progettazione dei nanodischi.

Nanodischi ovunque
Cercando strutture di nanodischi negli archivi PDB se ne possono trovare decine, ma sono pochissime quelle che contengono le coordinate dei lipidi del nanodisco. Questo perché i lipidi sono molto flessibili e i ricercatori sono più interessati alla proteina che è inserita nel nanodisco e così i lipidi circostanti restano sfuocati e non si vedono nella mappa della microscopia crioelettronica. La struttura enorme mostrata qui sopra (file PDB 4v6m) è un'eccezione, i ricercatori hanno usato la microscopia crioelettronica combinata con simulazioni di dinamica molecolare per generare un modello strutturale dell'intero complesso, compreso il nanodisco e i lipidi che lo costituiscono. Contiene un ribosoma che sta sintetizzando una proteina e la sta facendo uscire dalla membrana attraverso il canale formato dalla proteina esportatrice SecYE.

Nanodischi ed NMR
Dato che i nanodischi sono piccoli e solubili in acqua, sono stati una manna per i biologi strutturali che usano la tecnica NMR per studiare le proteine. La struttura mostrata qui a lato (file PDB 6clz) mostra il dominio legato alla membrana della proteina MT1-MMP (metallo tipo 1, metalloproteinasi di matrice), un enzima che taglia il collagene ed è necessario per consentire alle cellule di migrare attraverso la matrice extracellulare quando vengono costruiti nuovi vasi sanguigni. Questa proteina è anche un bersaglio per la chemioterapia del cancro perché le cellule tumorali che danno metastasi spesso usano questo enzima per diffondersi nel corpo. Questa struttura ha permesso ai ricercatori di esplorare due modi di legarsi del dominio e il loro ruolo nel regolare l'azione dell'enzima.








Esplorando la struttura
I nanodischi vengono realizzati con tecniche di ingegneria genetica a partire da apolipoproteine naturali, cambiando la lunghezza delle catene per circondare un disco delle dimensioni desiderate.
Le proteine ingegnerizzate sono chiamate MSP (membrane scaffolding proteins) proteine che supportano una membrana e, come le apolipoproteine, hanno una struttura ad alfa elica che dirige verso l'interno dell'anello una serie di amminoacidi apolari evidenziati nella figura qui a fianco con sferette (file PDB 6clz). Questi amminoacidi stabilizzano le code idrofobiche dei fosfolipidi di membrana.






















Nell'immagine qui sotto, realizzata con Chimera, si possono apprezzare meglio le strutture tridimensionali delle catene proteiche e dei fosfolipidi di questa struttura (file PDB 6clz).



E' interessante anche osservare nel dettaglio la struttura dei fosfolipidi che costituiscono il doppio strato lipidico della membrana. Qui a fianco sono mostrati sei fosfolipidi presi dalla struttura complessa del file PDB 6clz esaminato sopra.
Si tratta di sei lecitine, molecole composite che hanno al centro una molecola di glicerina (con i tre carboni evidenziati in verde, ognuno dei quali regge un ossigeno rosso).
La glicerina lega, sugli ossigeni del primo e del secondo carbonio, due acidi grassi con le catene idrocarburiche affiancate tra loro. Sull'ossigeno del terzo carbonio è legata una molecola di acido fosforico (arancione e rossa) a sua volta legata ad una colina (ossigeno rosso e azoto blu) in cui l'azoto è legato a tre metili e così diventa uno ione ammonio positivo.
La parte polare dei fosfolipidi è costituita dagli ossigeni dell'acido fosforico (negativi) e dall'azoto dello ione ammonio (positivo). Questa porzione polare è rivolta all'esterno verso l'ambiente acquoso polare.
La porzione apolare dei fosfolipidi è formata dalle code degli acidi grassi che si affiancano una all'altra formando una superficie apolare che aderisce alla superficie sottostante apolare del secondo strato di fosfolipidi.





























Spunti per ulteriori esplorazioni
Cercate "nanodisc" al EMDataResource per esaminare la mappe EM di queste proteine. Vedrete che il nanodisco è spesso non ben risolto.
Cercate "apolipoprotein" nel sito RCSB PDB per vedere la struttura di queste proteine quando non sono legate ai lipidi.

Bibliografia
6clz: Marcink, T.C., Simoncic, J.A., An, B., Knapinska, A.M., Fulcher, Y.G., Akkaladevi, N., Fields, G.B., Van Doren, S.R. (2019) MT1-MMP Binds Membranes by Opposite Tips of Its beta Propeller to Position It for Pericellular Proteolysis. Structure 27: 281-292.e6.
Denisov, I.G., Sligar, S.G. (2016) Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structural and Molecular Biology 6, 481-486.
4v6m: Frauenfeld, J., Gumbart, J., Sluis, E.O., Funes, S., Gartmann, M., Beatrix, B., Mielke, T., Berninghausen, O., Becker, T., Schulten, K., Beckmann, R. (2011) Cryo-EM structure of the ribosome-SecYE complex in the membrane environment. Nature Structural and Molecular Biology 18: 614-621.