Molecola del Mese
di David S. Goodsell
trad di Mauro Tonellato

Legumain


Molecola del Mese di Agosto 2018
L'enzima legumain taglia le proteine, ma le può anche legare insieme

Introduzione
All'enzima legumain sono stati dati nomi diversi a causa delle sue molte funzioni.
Nelle piante aiuta a trasformare le proteine nei vacuoli di riserva e quindi è stato chiamato enzima della trasformazione vacuolare.
Nelle nostre cellule elabora le proteine per il sistema immunitario generando i piccoli peptidi che vengono esposti dal complesso maggiore di istocompatibilità MHC (mdm 2-2005) e quindi è stato chiamato asparaginil endopeptidasi (dato che taglia le proteine in corrispondenza di un'asparagina).
Può agire anche come enzima che stacca amminoacidi dalla parte C-terminale di una proteina e per questa sua funzione ha avuto un altro nome. Alla fine gli scienziati hanno scelto un nome semplice "legumain" per riferirsi all'enzima che svolge tutte queste funzioni.

Forbici di cisteina
L'enzima legumain usa una triade di amminoacidi per realizzare la reazione di taglio delle proteine, cisteina, istidina e asparagina e quindi è detto proteasi alla cisteina. Questi tre amminoacidi sono molto simili ad un'altra triade di amminoacidi ben più famosa (serina, istidina, acido glutammico) che si trova nelle proteasi alla serina (tripsina mdm 10-2003, trombina mdm 1-2002).
Nelle proteasi alla serina, però, i tre amminoacidi sono disposti in fila a fianco della proteina che deve essere tagliata, mentre in legumain si trovano a cavallo della proteina: la cisteina (mostrata in giallo nella figura qui sopra) si trova da un lato mentre istidina e asparagina (in arancione) si trovano dal lato opposto e in mezzo si nota la tasca nella quale si dispone la proteina da tagliare.
Le proteasi alla cisteina non sono tutte così: in alcune, come nella caspasi (mdm 8-2004), la disposizione degli amminoacidi catalitici è simile a legumain, mentre in altre, come nella papaina, gli amminoacidi attivi sono disposti come nelle proteasi alla serina.
Legumain, inoltre, ha una piccola tasca di riconoscimento che le dona specificità,nella quale vi sono due amminoacidi carichi negativamente e altri due carichi positivamente. Questi amminoacidi riconoscono la catena laterale di una asparagina della proteina bersaglio e così permettono a legumain di tagliare la catena proprio in quel punto.


Taglia e cuci
Sorprendentemente, ulteriori studi su legumain hanno mostrato che è anche in grado di riconnettere catene proteiche. Per esempio legumain è coinvolta nella permutazione circolare della concanavalina A (mdm 4-2010) ed è anche coinvolta nella sintesi di peptidi ciclici che sono usati dalle piante come difesa. La reazione di sintesi del legame peptidico avviene nello stesso sito attivo che taglia le proteine, ma non coinvolge la cisteina, coinvolge invece un acido aspartico vicino all'istidina che assume una forma insolita ciclica.

Sicurezza delle proteasi
Gli enzimi proteasi possono essere pericolosi per la cellula se non agiscono sotto controllo. Legumain è prodotto dai ribosomi in forma inattiva, un proenzima (file PDB 4fgu) che ha un lungo segmento terminale inibitorio che blocca il sito attivo (mostrato in rosa chiaro).
Legumain svolge la sua azione nei vacuoli e negli endosomi dove vi sono altri enzimi proteolitici che tagliano via il suo segmento terminale e la attivano.
Un tipo di legumain delle piante (file PDB 5nij mostrata in basso) usa un tipo particolare di autoattivazione dipendente dal pH: le proteine inattive vengono legate tra loro per formare dei dimeri che ad un pH intorno a 7 possono aprire il sito attivo e svolgere la loro azione di proteasi e di ligasi.



















Esplorando la struttura

La struttura PDB 4n6o (in basso a sinistra) mostra legumain legata alla proteina inibitrice cistatina (azzurra). La cistatina ha una asparagina (evidenziata) che entra nella tasca di riconoscimento, ma viene tagliata molto lentamente e, anche se viene tagliata, è subito riconnessa da legumain. Per questo la cistatina resiste intatta abbastanza a lungo nel sito attivo di legumain da consentire ai ricercatori di cristallizzare le due proteine insieme.
La struttura PDB 4awb (in basso a destra) mostra, invece, legumain nel mezzo della sua azione di taglio di una proteina. Uno dei due frammenti dopo il taglio è stato espulso, mentre l'altro frammento (verde) resta legato alla cisteina del sito attivo come tioestere. Più avanti, una molecola d'acqua sarà usata per staccare il peptide e liberare la cisteina per consentirle di continuare la sua reazione enzimatica.
In entrambe le figure sono evidenziati i tre amminoacidi (in rosa) che operano la reazione enzimatica di proteasi: da sinistra a destra, asparagina, istidina, cisteina.



Le due immagini qui sotto mostrano in primo piano un acido aspartico (grigio) legato all'istidina (rosa) del sito attivo. Questo, nell'immagine di sinistra, si trova nella sua forma normale aperta, mentre a destra si è chiuso ad anello formando una amminosuccinimmide che si pensa sia importante per la reazione di ligasi.





Spunti per ulteriori discussioni
1. Provate a confrontare le strutture di Legumain (4awb) e Caspasi 1 (2hbq).
2. Molte altre proteine hanno un acido aspartico nella forma insolita di amminosuccinimmide. Potete vederne una lista di esempi alla pagina "Ligand Depot page for SNN"


Bibliografia
5nij: Zauner, F.B., Dall, E., Regl, C., Grassi, L., Huber, C.G., Cabrele, C., Brandstetter, H. (2018) Crystal structure of plant legumain reveals a unique two-chain state with pH-dependent activity regulation. Plant Cell 30: 686-699.
Dall, E., Brandstetter, H. (2016) Structure and function of legumain in health and disease. Biochimie 122: 126-150.
4n6o: Dall, E., Fegg, J.C., Briza, P., Brandstetter, H. (2015) Structure and mechanism of an aspartimide-dependent Peptide ligase in human legumain. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54: 2917-2921.
4awb, 4fgu: Dall, E., Brandstetter, H. (2013) Mechanistic and structural studies on legumain explain its zymogenicity, distinct activation pathways, and regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: 10940-10945.