Molecola del Mese
di David S. Goodsell
trad di Mauro Tonellato

Ribonucleasi A


Molecola del Mese di Settembre 2008

Ribonucleasi A
La Ribonucleasi A è l'enzima che degrada l'RNA durante la digestione. Dato che è una proteina relativamente piccola, stabile e facilmente purificabile, la ribonucleasi è stata uno degli enzimi più studiati nella ricerca biochimica. E' stata usata da Christian Anfinsen per dimostrare che la sequenza di amminoacidi è in grado di determinare la struttura tridimensionale di una proteina. E' stata usata da Stanford Moore e William Stein per dimostrare che il sito attivo degli enzimi è costituito da un particolare assetto tridimensionale di amminoacidi. La ribonucleasi A è stato anche il primo enzima sintetizzato da R. Bruce Merrifield col suo innovativo metodo di sintesi in fase solida che gli ha permesso di dimostrare che anche gli enzimi possono essere sintetizzati artificialmente.
Questi ricercatori hanno chiarito concetti fondamentali di biochimica, con l'aiuto della ribonucleasi, e sono stati tutti premiati col Premio Nobel.



Veloce e Aggressivo
La ribonucleasi A, mostrata qui sopra dal file PDB 5rsa, è una endonucleasi, questo significa che può tagliare l'RNA all'interno (endo) della catena.
Altre ribonucleasi degradano l'RNA a partire dalle estremità, come l'esosoma (mdm 02-2007) che è coinvolto nella degradazione dell'RNA all'interno delle cellule.
La ribonucleasi A lega la catena di RNA nella grande tasca che possiede al centro della struttura (vedi figura qui a fianco dal file PDB 1rta) e la attacca con un insieme di amminoacidi acidi e basici. La ribonucleasi A è un demolitore molecolare aggressivo che taglia molto velocemente l'RNA dopo le basi di citosina, oppure, però più lentamente, dopo quelle di uracile.
Nel corso dell'evoluzione, è diventata così efficiente che appartiene a quel ristretto gruppo di enzimi la cui attività non è limitata dalla propria velocità di reazione, ma dalla velocità di diffusione delle molecole che deve degradare.




Forte come una Roccia
La ribonucleasi A è incredibilmente stabile. Ad esempio, in uno dei passaggi per purificare la ribonucleasi A pancreatica bovina, gli estratti sono trattati con acido solforico e scaldati fino quasi all'ebollizione, la ribonucleasi è la sola proteina che sopravvive. Questo non deve sorprendere perchè è un enzima secreto dal pancreas e deve agire nell'intestino dove l'ambiente è decisamente inospitale. La stabilità della ribonucleasi A è dovuta in larga parte ai quattro ponti disolfuro che legano insieme parti diverse della catena proteica e la aiutano a mantenere una forma compatta.


Taglio di Precisione
La ribonucleasi A è uno strumento potente per tagliare l'RNA in pezzi, ma le cellule hanno bisogno anche di altri strumenti per fare alcune modifiche mirate ai loro RNA. Per esempio, le molecole di RNA transfer (Molecola del Mese di marzo 2001) vengono sintetizzate più lunghe del necessario e poi devono essere accorciate fino alla giusta lunghezza.
La ribonucleasi Z, mostrata qui a fianco sulla sinistra (file PDB 2fk6), accorcia la catena dalla parte che lega l'amminoacido. Questa struttura contiene l'enzima nella sua forma dimera (blu chiaro e blu scuro) e un tratto delle molecole dei due RNA transfer (arancione).
La ribonucleasi P, che è formata da due catene proteiche e da un ribozima (un enzima a base di RNA), accorcia la catena dall'altro lato (non illustrata qui).
La ribonucleasi III, mostrata sulla destra (file PDB 2ez6) si lega attorno a sequenze di RNA a doppia elica e realizza alcuni tagli specifici, necessari per il funzionamento e la regolazione dell'RNA ribosomiale e messaggero.













Esplorando la Struttura
La ribonucleasi A è una macchina molecolare pericolosa per le cellule perchè taglia in modo indiscriminato ogni RNA che incontra. E' tossica per le cellule al punto che è stata anche sperimentata come farmaco anticancro. Sfortunatamente si è rivelata tossica non solo per le cellule cancerose, ma anche per quelle normali e quindi il suo uso in chemioterapia è stato abbandonato. Le cellule si difendono dalla ribonucleasi A (mostrata qui in blu) sintetizzando potenti inibitori come quello mostrato qui in verde (file PDB 1dfj). Questi inibitori si legano immediatamente ad ogni molecola di ribonucleasi A che riesce ad entrare nella cellula. Il legame che realizzano è molto forte a causa della vasta superficie di contatto tra le due molecole, infatti l'inibitore si avvolge quasi completamente intorno alla ribonucleasi.

Notate la struttura insolita dell'inibitore che ha una forma molto simmetrica a corona con tante porzioni alfa elica all'esterno (in rosso nella figura qui sotto) e altrettante porzioni beta pieghe all'interno (in giallo).




E' anche interessante notare che la struttura dell'inibitore è stabilizzata dalle interazioni apolari tra amminoacidi di leucina (evidenziati con gli atomi a forma di piccole sfere) che sporgono abbondanti nella porzione interna dell'inibitore tra le alfa eliche e le strutture beta pieghe come si vede nella figura qui a lato.


















Spunti per ulteriori approfondimenti
=> La struttura PDB 5rsa è stata risolta anche per diffrazione di neutroni, una tecnica in grado di determinare la posizione degli atomi di idrogeno, che invece sono invisibili nella diffrazione ai raggi x. L'esperimento è stato condotto su cristalli che si erano formati in acqua deuterata (acqua pesante). Nella struttura 5rsa, infatti, tutte le molecole d'acqua sono DOD (un atomo di ossigeno e due di deuterio) e anche molti degli atomi di idrogeno della proteina sono stati sostituiti da deuterio per scambio con acqua pesante, il solvente. Potete fornire una spiegazione del perchè in alcune posizioni nella proteina si trova deuterio, mentre in altre restano gli idrogeni originali?

=>Negli archivi PDB sono disponibili molte strutture di ribonucleasi che contengono vari inibitori all'interno del sito attivo. Potete trovare degli esempi nei quali gli inibitori sono simili all'RNA che normalmente viene tagliato dall'enzima?

=> I quattro ponti disolfuro della ribonucleasi A fissano la proteina nella sua forma attiva. Quanti di questi legami connettono porzioni distanti della catena e quanti legano, invece, porzioni più vicine stabilizzando così solo una piccola ansa?

Bibliografia

R. T. Raines (1998) Ribonuclease A. Chemical Reviews 98, 1045-1065.

K. A. Dickson, M. C. Haigis and R. T. Raines (2005) Ribonuclease Inhibitor: Structure and Function. Progress in Nucleic Acid Research 80, 349-374.

G. R. Marshall, J. A. Feng and D. J. Kuster (2007) Back to the Future: Ribonuclease A. Peptide Science 90, 259-277.