Molecola del Mese
di David S. Goodsell
trad di Mauro Tonellato

DNA Ligasi


Molecola del Mese di Luglio 2004

DNA Ligasi
Tutte le cellule umane (con alcune particolari eccezioni) contengono il patrimonio genetico completo formato da 46 lunghi filamenti di DNA a doppia elica. Tutte le nostre informazioni genetiche sono codificate in questi filamenti che sono costituiti da migliaia di geni incolonnati uno dopo l'altro. La sequenza dei geni e la loro vicinanza reciproca, possono essere importanti per l'uso corretto delle informazioni genetiche, quindi è importante che le nostre cellule proteggano il proprio DNA da ogni possibile rottura accidentale. Se uno dei due filamenti del DNA si rompe non è un dramma, ma possono sorgere dei problemi se questo accade quando il DNA a doppia elica è svolto durante i processi di trascrizione e replicazione. La rottura di entrambi i filamenti, invece, è molto più pericolosa. Per proteggerci da questi pericoli, le nostre cellule usano la DNA ligasi, un enzima in grado di ricucire insieme i filamenti di DNA che sono stati rotti.

Rompere il DNA
Alcune insidie ambientali possono danneggiare accidentalmente il DNA. Per esempio, le radiazioni ionizzanti, come i raggi gamma e i raggi x, attaccano la catena del DNA e la spezzano in più punti. L'ossigeno, al quale le nostre cellule sono continuamente esposte, è un gas pericoloso che può formare radicali liberi molto reattivi che attaccano il DNA. Sorprendentemente alcune nostre cellule spezzano intenzionalmente il proprio DNA. Durante la meiosi, il processo nel quale il genoma è diviso in due metà per la creazione di cellule uovo o di spermatozoi, il DNA viene ricombinato. Porzioni di un filamento di DNA sono tagliate e scambiate con porzioni simili prelevate dal cromosoma omologo. Le cellule del sistema immunitario rimescolano i loro filamenti di DNA, tagliando dei frammenti da una posizione per introdurli in una posizione diversa e ottenere così un nuovo insieme di geni anticorpali. Buche e interruzioni in un filamento di DNA vengono anche create durante la replicazione. La DNA polimerasi può lavorare solamente in una direzione quando copia un filamento di DNA, così solo uno dei due filamenti della doppia elica viene copiato in modo continuo, mentre l'altro viene copiato in una serie di piccoli pezzi che hanno bisogno di essere collegati insieme dalla DNA ligasi per formare un filamento continuo.

Riparare il DNA spezzato
La DNA ligasi è in grado di ricucire i due frammenti di una catena di DNA che è stata spezzata. Per compiere la reazione usa un cofattore (rosso) per l'energia ed un particolare amminoacido di lisina (magenta). La DNA ligasi umana e quella del batteriofago T7, mostrata qui a destra in alto (file PDB 1a0i) usano ATP come cofattore. Molti batteri, invece, usano NAD nella reazione, come la DNA ligasi mostrata qui a destra (file PDB 1dgs). In entrambi i casi, una lisina nella DNA ligasi forma un legame col fosfato del cofattore, legandosi con la porzione di AMP, adenosinamonofosfato, e scartando il resto. Più tardi, nella reazione, questo AMP viene prima trasferito al filamento di DNA rotto, e poi rilasciato quando il filamento viene ricucito.

Manipolare i Geni
La DNA ligasi è un enzima estremamente utile, sia nelle cellule che fuori. Insieme con gli enzimi di restrizione (mdm 8-000), ha reso possibile lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante. Con questi due enzimi, i ricercatori possono tagliare e ricucire a piacimento i filamenti di DNA, realizzando nuovi geni e nuovi genomi. Gli enzimi di restrizione sono come forbici, che permettono di tagliare il DNA in punti specifici. La DNA ligasi permette poi di riconnetterli insieme per ottenere filamenti di DNA funzionanti. Con questa tecnologia, siamo in grado di fare in laboratorio quello che le cellule hanno fatto per miliardi di anni!

Congiunzione non-omologa
Un'altra reazione importante compiuta dalla DNA ligasi è la congiunzione non-omologa. Si verifica quando entrambi i filamenti del DNA si rompono, e la cellula deve incollarli di nuovo insieme. È un sistema di riparazione d'emergenza, quindi può introdurre uno o due errori nelle informazioni genetiche mentre le due terminazioni vengono preparate per essere riunite, ma questo è certamente meglio che lasciare il DNA spezzato in frammenti.
Alcune delle molecole coinvolte nel processo sono mostrate qui a lato. Si ritiene che la proteina Ku (file PDB 1jey) ed una proteina chinasi DNA dipendente (non mostrata) avvicinino le due terminazioni e le tengano ferme nella giusta posizione. Notate come le due subunità di Ku hanno dei bracci che si avvolgono attorno ai filamenti di DNA. La DNA ligasi, aiutata dalla proteina Xrcc4 (file PDB 1ik9), ricuce insieme i filamenti. La DNA ligasi è mostrata in modo schematico, perchè la struttura atomica della forma umana non è stata ancora risolta.







Esplorando la Struttura
Nella figura qui a lato di DNA ligasi di Clorella virus (file PDB 1fvi) si può vedere in dettaglio la molecola di AMP attivata che viene usata nella reazione di ricucitura. La DNA ligasi di Clorella virus è una versione più piccola di quella che si trova nelle nostre cellule. La Lisina 27 forma un legame covalente col fosfato dell'AMP, e così lo prepara per la reazione di ricucitura. Il DNA si legherà nel grande incavo in alto.











Bibliografia

A. J. Doherty and S. W. Suh (2000) Structural and Mechanistic Conservation in DNA Ligases. Nucleic Acids Research 28, 4051-4058.

D. C. van Gent, J. H. J. Hoeijmakers and R. Kanaar (2001) Chromosomal Stability and the DNA Double-stranded Break Connection. Nature Reviews Genetics 2, 196-206.