Molecola del Mese
di David S. Goodsell
trad di Mauro Tonellato

Proteina Fluorescente Verde
(GFP)


Molecola del Mese di Giugno 2003

Proteina Fluorescente Verde
La proteina fluorescente verde, illustrata nella figura qui a lato (file PDB 1gfl) si trova in una medusa che vive nelle acque fredde del nord Pacifico. La medusa contiene una proteina bioluminescente, aequorina, che emette luce blu. La proteina fluorescente verde converte questa luce in luce verde che è quella che davvero vediamo quando la medusa si illumina. Una soluzione di proteina GFP purificata appare gialla alla normale luce da interni ad incandescenza, ma quando viene osservata in esterni alla luce del sole, questa soluzione emette un brillante colore verde. La proteina assorbe la luce ultravioletta dalla luce del sole, e poi la emette come luce verde di minore energia.

Inseguire la luce verde
Forse state dicendo: a chi interessa questa oscura piccola proteina verde di medusa? Risulta che la proteina GFP è straordinariamente utile alla ricerca scientifica, perché ci permette di osservare direttamente il funzionamento interno delle cellule. È facile scoprire dove si trova in ogni momento la proteina GFP: basta illuminare con luce ultravioletta, ed ogni proteina GFP emetterà luce verde brillante. Quindi ecco il trucco: basta legare la proteina GFP ad ogni oggetto che vogliamo osservare. Per esempio, possiamo legarla ad un virus. Poi, quando il virus si diffonde nell'ospite, possiamo seguire questa diffusione seguendo il bagliore verde. Oppure, possiamo legarla ad un'altra proteina, e guardare con un microscopio come si muove all'interno della cellula.

Costruita già pronta
La proteina GFP è una proteina fluorescente costruita già pronta per funzionare, quindi è particolarmente facile da utilizzare. La maggior parte delle proteine che interagiscono con la luce utilizzano molecole esotiche per catturare e rilasciare fotoni. Per esempio, le opsine nei nostri occhi usano il retinolo per sentire la luce (si veda la Molecola del Mese del marzo 2002 bacteriorhodopsin). Questi "cromofori" devono essere costruiti appositamente per svolgere questo compito e poi incorporati con cura nelle proteine. La proteina GFP, invece, ha dentro di sè tutto l'apparato per manipolare la luce, costituito utilizzando solo amminoacidi. Ha una sequenza speciale di tre amminoacidi: serina-tirosina-glicina (qualche volta, la serina è sostituita da treonina, un amminoacido simile). Quando la catena proteica si avvolge, questo piccolo segmento si trova sepolto in profondità all'interno della proteina. A questo punto avvengono alcune trasformazioni chimiche: la glicina forma un legame chimico con la serina, formando un nuovo anello chiuso che poi spontaneamente si disidrata. Infine, nel corso di circa un'ora, l'ossigeno dall'ambiente circostante attacca un legame nella tirosina, formando un nuovo doppio legame e creando il cromoforo fluorescente. Dato che la proteina GFP costruisce al suo interno il proprio cromoforo, è perfetta per l'ingegneria genetica. Non bisogna preoccuparsi di manipolare strani cromofori. Basta semplicemente modificare la cellula introducendo le istruzioni genetiche per costruire la proteina GFP, e la GFP si avvolgerà da sola e comincerà a brillare.

Ingegnerizzare la proteina GFP
Gli usi della proteina GFP si stanno moltiplicando anche nel mondo dell'arte e del commercio. L'artista Eduardo Kac ha creato un coniglio verde fluorescente ingegnerizzando la proteina GFP nelle sue cellule. Alcuni ricercatori stanno esplorando la proteina GFP per creare piante e pesci fluorescenti. La proteina GFP è stata aggiunta a ratti, topi, rane, mosche, vermi, e ad altre innumerevoli forme viventi . Naturalmente queste piante e animali ingegnerizzati sono ancora oggetto di controversie, e stanno stimolando un importante dialogo sulla sicurezza e la moralità dell'ingegneria genetica.

Migliorare la proteina GFP
La proteina GFP è straordinariamente utile per studiare le cellule viventi, e i ricercatori stanno rendendola ancora più utile. Stanno inserendo con l'ingegneria genetica molecole di proteina GFP che emettono per fluorescenza colori diversi. I ricercatori ora possono fare proteine blu fluorescenti, proteine gialle fluorescenti e molte altre ancora. Il trucco è introdurre piccole mutazioni che alterano la stabilità del cromoforo. Migliaia di varianti diverse sono già stata sperimentate, e nel PDB se ne possono trovare molte che si sono dimostrate funzionanti.
I ricercatori stanno anche usando la proteina GFP per creare dei biosensori: macchine molecolari che sentono i livelli di ioni o il pH, e che poi trasmettono i risultati diventando fluorescenti in modi caratteristici. La molecola mostrata qui a lato (file PDB 1kys) è una proteina fluorescente blu che è stata modificata per sentire il livello di ioni zinco. Quando lo zinco (rosso) si lega al cromoforo modificato (blu) la proteina diventa due volte più fluorescente, creando un segnale visibile che può essere facilmente osservato.









Esplorando la Struttura
Nella figura qui a lato (file PDB 1ema) potete osservare da vicino il cromoforo della proteina GFP. Sulla sinistra è mostrata la catena principale completa della proteina. La catena proteica è rappresentata con un tubo cilindrico blu, con una porzione della catena che entra nel cilindro e lo attraversa passando all'interno (verde). Il cromoforo si trova proprio nel mezzo del tubo, totalmente schermato dall'ambiente circostante. Questa schermatura è essenziale per la fluorescenza. Le molecole d'acqua accalcandosi attorno al cromoforo gli ruberebbero l'energia dopo che questo ha assorbito un fotone. All'interno della proteina, il cromoforo è protetto, e può rilasciare l'energia emettendo un fotone di luce di energia leggermente inferiore. Il cromoforo (mostrato in primo piano sulla destra) si forma spontaneamente a partire da tre amminoacidi nella catena proteica: una glicina, una tirosina e una treonina (o una serina). Notate che la glicina e la treonina hanno formato un nuovo legame, creando un insolito anello a cinque atomi.

Queste immagini sono state create con Chime (vedi chimica al computer). Anche voi potete creare immagini simili scaricando i file PDB dell'articolo, decomprimendoli e poi lanciandoli con Internet Explorer (se avete scaricato il plug-in Chime)
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Il cromoforo nel file PDB 1ema è denominato "CRO" ed è il residuo numero 66 della catena proteica.

Bibliografia

Roger Y. Tsien (1998): The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry 67, pp. 509-544.