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Chimica.it

Responsabile:
Prof. Mauro Tonellato
MODELLISTICA MOLECOLARE CON MGL TOOLS

STRUTTURA DELLE PROTEINE
   


Lezioni con
MGL Tools / AutoDock

Struttura delle Proteine
Proteine e Legandi
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Le proteine sono macromolecole molto complesse, la loro struttura può essere capita più facilmente con l'aiuto di un programma di modellistica molecolare come MGL Tools. Questo programma ci mostra la proteina in modo tridimensionale nello schermo del computer e ci consente di esaminarla e manipolarla come se fosse un oggetto nelle nostre mani. Questo non solo ci aiuta a capire meglio il significato di struttura primaria, secondaria, terziaria e quaternaria delle proteine, ma ci permette di comprendere meglio anche altre proprietà delle proteine, come l'interazione legando - sito attivo negli enzimi o l'azione degli inibitori.
Questa lezione può essere affrontata in due modi.
1) Online. Potete leggere le istruzioni ed eseguirle passo passo al computer con MGL Tools, aiutandovi con le illustrazioni che chiariscono ogni passaggio.
2) In aula informatica con la classe. Se siete insegnanti di chimica, potete adattare la lezione alle esigenze della vostra classe e proporla in aula informatica ai vostri allievi.
La durata della lezione è di circa tre ore.
N.B. Cliccando sulle figure potrete vedere le immagini a pieno schermo.

Gli argomenti di questa lezione sono:
-- Struttura primaria, secondaria, terziaria, quaternaria delle proteine


Recettore dell'acetilcolina
In questa prima lezione sulle proteine, studieremo il recettore dell'acetilcolina. Questo è un recettore proteico che si trova sulla superficie delle cellule muscolari nelle sinapsi nervo-muscolo. Quando l'impulso nervoso arriva alla fine del neurone, questo rilascia un getto di neurotrasmettitori come l'acetilcolina, che giunge alla cellula muscolare dove si lega a specifici recettori il cui poro centrale si apre e lascia entrare un flusso di ioni sodio che innesca la contrazione muscolare.
Negli archivi PDB (Protein Data Bank) vi sono molte strutture di recettori dell'acetilcolina. Qui useremo la struttura 1uv6 (mostrata in figura 1), anzi, per cominciare, ne useremo solo un frammento creato per questa lezione, 1uv6_tut (figura 2), che contiene solo 2 delle 5 catene proteiche che la molecola possiede in natura.


Aprire il file PDB
Scaricate il file 1uv6_tut.pdb e collocatelo in una cartella che chiamerete Acetilcolina nella root directory c:\.
Lanciate MGL Tools e cliccate File / Preferences / Set per aprire una finestra di dialogo, quindi scrivete in Startup Directory la posizione della cartella Acetilcolina, c:\Acetilcolina.
In MGL Tools cliccate File / Read Molecule e aprite il file 1uv6_tut.pdb.


1uv6 - fig. 1


1uv6_tut - fig. 2





















figura 3



























fig. 4


fig. 5






























figura 5b


Stuttura Primaria

La struttura primaria di una catena proteica è semplicemente la sua sequenza di amminoacidi.
Per metterla in evidenza procedete così:
nella finestra di sinistra di MGL Tools, dove si trova la struttura ad albero della molecola, cliccate sul triangolino azzurro a lato di 1uv6_tut e vedrete le subunità C e D presenti in questa struttura.
Cliccate sul triangolino accanto a C vedrete la sequenza di amminoacidi della catena C (figura 3).



Gli amminoacidi vengono numerati a partire dal lato N terminale.
La catena C inizia sul lato N terminale con LEU-1 e ASP-2 e termina sul lato C terminale con LYS-204 e GLY-205 . Scorrendo verso il basso gli amminoacidi della catena C troviamo, dopo GLY-205, la molecola del legando contenuto in questa proteina, CCE-1206, carbammilcolina, un analogo dell'acetilcolina.

Muovendo il mouse col pulsante sinistro premuto, si può ruotare la proteina.
Agendo sulla rotellina centrale del mouse, si può ingrandire o rimpicciolire l'immagine.
Muovendo il mouse col pulsante destro premuto, si può traslare la proteina.

Gli amminoacidi che costituiscono la molecola sono rappresentati con semplici linee. E' possibile usare rappresentazioni diverse usando il menu della finestra di sinistra di MGL Tools (fig. 3).
Questo menù è composto da più colonne
Colonna S (Select) seleziona gli amminoacidi.
Colonna L (Lines) rappresenta gli amminoacidi con linee.
Colonna B (Balls and Sticks) rappresenta gli amminoacidi con palline e bastoncini.
Colonna C (Spheres) rappresenta gli atomi con grosse sfere.
Colonna R (Ribbons) rappresenta la proteina con un nastro evidenziando la sua struttura secondaria ad alfa elica, beta a pieghe o random coil.
Colonna MS (Molecular Surface) rappresenta la superficie della proteina.
Colonna L (Labels) inserisce i nomi di atomi, molecole, amminoacidi o catene.
Colonna Cl (Colors) modifica i colori di atomi, molecole, amminoacidi o catene.

Proviamo a rappresentare i primi due amminoacidi con Balls and Sticks con i colori tipici dei singoli atomi (C grigio, N blu, O rosso, S giallo, H bianco).
Selezionate i primi due amminoacidi, LEU-1 (leucina) e ASP-2 (acido aspartico) cliccando sui due quadratini corrispondenti nella colonna S (diventano gialli).
Cliccate sui cerchietti (diventano rossi) della colonna B di LEU-1 e ASP-2 per rappresentarli con Balls and Sticks
Ruotate, traslate e ingrandite la proteina per portare in primo piano gli amminoacidi selezionati.
Cliccate ora sul triangolino della colonna Cl per accedere al menù di colorazione di LEU-1. Su questo cliccate balls, sticks, e poi scegliete By atom type come mostrato in figura 4.
Ripetete la procedura per ASP-2.
Deselezionate i due amminoacidi, LEU-1 e ASP-2
Otterrete l'immagine mostrata in figura 5 (cliccate sull'immagine per ingrandirla).

Essendo LEU-1 l'amminoacido che inizia la catena, il suo gruppo alfa-amminico è libero (atomo blu in alto), mentre il suo carbonio del carbossile (carbonio grigio legato all'ossigeno rosso) è legato all'azoto (blu) di ASP-2. Dal carbossile di ASP-2 si vede la catena proteica che continua come linea sottile.
I due amminoacidi si riconoscono dalla loro catena laterale: una catena di carboni ramificata, un isobutile, per la leucina 1. Una catenella di due carboni che termina con un carbossile per l'acido aspartico 2.
Esercitatevi a riconoscere gli amminoacidi dalla loro catena laterale. Sulla destra in figura si vede la catena laterale di un'asparagina, sulla sinistra si notano le catene di un acido aspartico e di un'altra asparagina.
Notate inoltre che il legame peptidico è planare, cioè i 6 atomi legati agli orbitali sp
2 del legame peptidico sono tutti sullo stesso piano.
Per evidenziare questo fatto selezionate i primi tre amminoacidi della catena C (LEU1, ASP2, ARG3) e salvateli col nome 1uv6_aa (che potete anche scaricare qui).
Cancellate la proteina 1uv6_tut e aprite il tripeptide appena salvato 1uv6_aa.
Selezionate la rappresentazione Balls and Sticks (colonna B), colorate la struttura (colonna Cl) scegliendo (in Geometry) balls e sticks e poi (in Color Scheme) By atom type (figura 4).
Nella finestra Tools impostate il valore minimo di fog intorno a 26 (un po' minore di quello massimo, 35) per vedere ben illuminata tutta la struttura.

Aggiungete gli idrogeni alla struttura, dato che mancano nel file PDB originale.
Selezionate: Edit / Hydrogens / Add e poi cliccate OK.
Ora scegliete: Edit / Hydrogens / Merge non Polar e cliccate Continue.
Nella struttura rimangono visibili solo gli idrogeni polari come si vede in figura 5b.

I 6 atomi coplanari del primo legame peptidico (tra Leu-1 e Asp-2) sono stati indicati con i numeri da 1 a 6.
Anche i successivi 6 atomi della catena sono coplanari (atomi 6, 7, ecc) perchè sono coinvolti nel secondo legame peptidico (tra Asp-2 e Arg-3), ma il loro piano è ruotato rispetto al precedente.
Lo snodo tra i due piani è il carbonio alfa dell'acido aspartico (atomo 6) che consente alla struttura di ruotare sia attorno al legame 4-6 che attorno al legame successivo 6-7 dove 7 è il carbonio del carbonile di Asp.



fig. 6






figura 7











Struttura Secondaria

La struttura secondaria di una proteina è la sua struttura tridimensionale locale.
Per metterla in evidenza procedete così:
Chiudete e riaprite MGL Tools.
Aprite 1uv6_tut, deselezionate il cerchietto rosso nella colonna L per non vedere più gli amminoacidi.
Selezionate il cerchietto nella colonna R per rappresentare la proteina con un nastro (Ribbon).
Per colorare la struttura cliccate il triangolo nella colonna Cl e scegliete By secondary structure, come in figura 6
Nella finestra Tools impostate il valore minimo di fog intorno a 150 (un po' minore di quello massimo, 173) per vedere la molecola ben illuminata.

Otterrete la struttura mostrata qui sotto, in figura 7.

I colori, giallo, rosso e bianco, rappresentano le tre principali strutture secondarie delle proteine.
giallo = beta pieghe (beta strand)
rosso = alfa elica (alpha helix)
bianco (e azzurro) = avvolgimento casuale (random coil)




















fig. 8


















fig. 9


fig. 11


fig. 12


Struttura beta pieghe
.
Esaminiamo per prima la struttura beta. Ogni legame peptidico si trova adagiato su un foglietto e rivolge il calbonile da un lato e il legame NH dal lato opposto. Ogni foglietto è allineato ai successivi formando una specie di fisarmonica che dà il nome alla struttura (beta pieghe).

Dato che l'ossigeno dei calbonili e l'idrogeno degli NH sporgono lateralmente verso l'esterno, i tratti con avvolgimento beta pieghe sono stabilizzati dalla formazione di legami idrogeno con un'altra catena beta pieghe vicina. Per questo motivo i tratti beta pieghe non si trovano mai da soli, ma sono affiancati uno all'altro e, inoltre, sono prevalentemente antiparalleli (osservate la posizione dei gruppi COOH termiali qui sotto o la direzione delle frecce gialle in figura 8).

Nella proteina che stiamo studiando, il recettore dell'acetilcolina, le catene beta sono organizzate per formare una struttura a tubo come è evidente in figura 7. Le cinque subunità formano quindi cinque strutture a tubo che, allontanandosi o avvicinandosi tra loro, possono aprire o chiudere il poro per gli ioni sodio (visibile al centro in figura 1).

I legami idrogeno
tra le catene beta possono essere messi in evidenza seguendo la procedura descritta qui sotto.
Individuiamo un punto nella subunità C nel quale ci siano almeno tre segmenti beta pieghe affiancati come in figura 8.
Selezionando a turno gli amminoacidi delle varie zone beta pieghe (evidenziati da una cornice gialla) si possono individuare gli amminoacidi di questi tre segmenti: si trovano nei tratti 72-77 e 101-114.
Selezionate uno per uno questi 20 amminoacidi e poi salvateli col nome 1uv6_beta.pdb.
La sequenza 101-114 è costituita da un stesso tratto di catena che si ripiega su se stesso per creare un appaiamento antiparallelo di strutture beta pieghe che è chiamato a "forcina".
Chiudete e riaprite MGL Tools.
Aprite il piccolo tratto di proteina appena salvato 1uv6_beta.pdb (potete anche scaricarlo qui).
Selezionate la vista Balls and Sticks (colonna B)
Nella finestra Tools impostate il valore minimo di fog intorno a 50 (un po' minore di quello massimo, 57) per vedere meglio la struttura più lontana da voi.
Aggiungete gli idrogeni alla struttura, dato che mancano nel file PDB originale.
Selezionate: Edit / Hydrogens / Add e poi cliccate OK.
Ora scegliete: Edit / Hydrogens / Merge non Polar e cliccate Continue.
Nella struttura rimangono visibili solo gli idrogeni polari (figura 9). Si vede chiaramente che gli idrogeni degli N-H di una catena sono rivolti verso gli ossigeni dei carbonili C=O della catena di fronte.

Cliccate ora: Hydrogen Bonds / Build / Set Parms + Build. Compare una finestra nella quale dovete cliccare Specify two sets e così potete scegliere quali legami idrogeno costruire.
Cliccate AtomSet List e scegliete backbone+h come è mostrato in figura 10.

figura 10

Dopo aver premuto OK, compare una finestra che annuncia che sono stati individuati 9 legami idrogeno.
Cliccate ora Hydrogen Bonds / Display / As Spheres e vedrete i 9 legami idrogeno rappresentati con piccole sfere verdi come in figura 11. Ogni singolo legame idrogeno può essere acceso o spento cliccando sulla sua stringa nella finestra di dialogo.

Accendete infine la rappresentazione Ribbon nella colonna R per vedere meglio la struttura beta pieghe collegata dai legami idrogeno come in figura 12.
Notate che le catene R degli amminoacidi sporgono alternativamente sopra e sotto il piano del foglietto beta
La struttura beta pieghe delle proteine, a causa dei legami idrogeno intercatena, è appiccicosa, cioè può aggregarsi ad altre catene proteiche con struttura beta pieghe come se fossero striscie di nastro adesivo. In casi eccezionali questa appiccicosità può formare aggregati proteici sempre più grandi che non sono più degradabili dagli enzimi proteolitici delle cellule. Il morbo di Alzheimer, per esempio, è dovuto all'aggregazione di un piccolo peptide che inizialmente è avvolto con struttura ad alfa elica, ma può riarrangiarsi ed assumere struttura beta a pieghe. Questo peptide è noto come peptide beta amiloide perchè, quando assume la conformazione beta, può produrre degli aggregati che continuano a crescere fino a rompere le cellule nervose in cui si trovano per poi fondersi con quelli vicini formando dei grumi così grandi che sono visibili al microscopio ottico e ricordano le sferette di amido delle cellule vegetali. Intere zone del cervello risultano danneggiate in modo permanente.




fig. 13


fig. 14


fig. 15


fig. 16


Struttura ad
alfa elica

Nell'alfa elica, la proteina si avvolge su se stessa con spire destrorse dalle quali le catene R degli amminoacidi sporgono a raggiera.
L'alfa elica è stabilizzata da legami idrogeno interni alla catena, paralleli all'asse, che legano tra loro amminoacidi che si trovano su spire successive. Ponendo in alto il lato N-terminale, gli ossigeni dei carbonili C=O sono rivolti in basso e formano legami idrogeno con gli idrogeni dei gruppi NH rivolti verso l'alto. Le strutture ad alfa elica, quindi non sono appiccicose e non tendono a formare aggregati.

Chiudete e riaprite MGL Tools.
Aprite 1uv6_tut.pdb, togliete la rappresentazione a linee (colonna L) e selezionate, per la catena C, la rappresentazione Ribbon (colonna R), infine colorate il nastro (colonna Cl) a seconda della struttura secondaria (figura 6).
La catena C contiene una sola alfa elica (rossa) mostrata nella figura qui a fianco (figura 13).
Individuate gli amminoacidi dall'alfa elica (evidenziati da una cornice rossa): si trovano nel tratto tra ARG-3 e GLN-12.
Selezionate uno per uno i 13 amminoacidi da ASP-2 a SER-14 e poi salvateli col nome 1uv6_alfa.pdb.
Chiudete e riaprite MGL Tools.
Aprite il piccolo tratto di proteina appena salvato 1uv6_alfa.pdb (potete anche scaricarlo qui).
Selezionate la vista Balls and Sticks (colonna B).
Nella finestra Tools regolate i valori minimo e massimo di fog per vedere ben illuminata la struttura.
Selezionate la rappresentazione Ribbon (colonna R) e coloratela in base alla struttura secondaria.
Otterrete l'immagine di figura 14 nella quale sono ben visibili le catene R degli amminoacidi che sporgono radialmente

I legami idrogeno
intracatena possono essere messi in evidenza seguendo la procedura descritta qui sotto.
Togliete la rappresentazione Ribbon (colonna R)
Aggiungete gli idrogeni
alla proteina.
Selezionate: Edit / Hydrogens / Add e poi cliccate OK.
Ora scegliete: Edit / Hydrogens / Merge non Polar e poi cliccate Continue.
Nella struttura rimangono visibili solo gli idrogeni polari. Osservate che gli idrogeni degli N-H della catena ad alfa elica sono rivolti verso l'alto e si avvicinano agli ossigeni dei carbonili C=O della spirale soprastante che sono tutti rivolti in basso.


Cliccate ora: Hydrogen Bonds / Build / Set Parms + Build. Compare una finestra nella quale dovete cliccare Specify two sets e così potete scegliere quali legami idrogeno costruire, cliccate AtomSet List e scegliete backbone+h come è mostrato in figura 10.
Dopo aver premuto OK, compare una finestra che annuncia che sono stati individuati 8 legami idrogeno.
Cliccate ora Hydrogen Bonds / Display / As Spheres e vedrete 8 legami idrogeno rappresentati con piccole sfere verdi come in figura 15. Oni singolo legame idrogeno può essere acceso o spento cliccando sulla sua stringa nella finestra di dialogo.










Accendete infine la rappresentazione Ribbon (colonna R) per vedere la struttura ad alfa elica con i legami idrogeno intracatena come in figura 16.
Si nota molto bene che i legami idrogeno mantengono compatte le varie spire. Se la proteina è posta in acqua calda, i legami idrogeno si rompono e l'alfa elica si allunga fino a scomparire.
Questo è quello che succede
quando si lavano i capelli con acqua calda, l'alfa elica delle proteine del capello (alfa cheratina) si allenta e le fibre si allungano. I capelli appena lavati, infatti, sono un po' più lunghi, ma tornano della lunghezza normale quando si asciugano e i legami idrogeno si riformano ripristinando la struttura ad alfa elica.















fig. 17


fig. 18


fig. 19


Struttura Terziaria

La struttura terziaria di una proteina è la struttura tridimensionale complessiva di una catena proteica.
In figura 17 è mostrata la struttura terziaria della catena C.
Ogni catena proteica ha la propria struttura tridimensionale che è la più stabile tra tutte quelle possibili, cioè corrisponde ad un minimo di energia. La proteina assume spontaneamente questa configurazione a mano a mano che viene sintetizzata, a meno che non sia troppo piccola come l'insulina (che viene sintetizzata con una catena più lunga che le consente di avvolgersi e poi viene tagliata) o molto grande e allora ha bisogno di un aiuto da parte dei Chaperon, grosse proteine a forma di barile nella cui cavità le proteine trovano un ambiente ideale per avvolgersi, privo di interferenze.
In generale gli amminoacidi apolari tendono ad occupare la parte più interna della proteina in modo da interagire tra loro piuttosto che con il solvente acquoso nel quale la proteina è immersa. Gli amminoacidi polari, invece, si rivolgono all'esterno, verso l'acqua. Questo comportamento ricorda quello dei saponi che si organizzano in micelle con le code apolari rivolte al centro e le teste polari rivolte all'esterno.
Le proteine di membrana, come il recettore dell'acetilcolina, fanno eccezione a questa regola e hanno una zona apolare in superficie, quella che deve essere immersa nello strato di fosfolipidi della membrana cellulare.

Per ottenere l'immagine di figura 17 procedete così:
Chiudete e riaprite MGL Tools.
Aprite 1uv6_tut.pdb e selezionate la catena D, quindi cancellatela con Edit / Delete / Delete Selected Atoms.
Nella catena C (unica rimasta) deselezionate la rappresentazione a linee (colonna L) e selezionate la rappresentazione Ribbon (colonna R). Colorate il nastro (colonna Cl) con l'opzione By Secondary Structure.
Andate sul legando CCE-1206 e selezionate la rappresentazione a Sfere (colonna C), quindi coloratela (colonna Cl) scegliendo geometria cpk e By atom type. Infine aggiustate i valori di fog nel menù Tools per vedere chiaramente la struttura (figura 17).

Per valutare la polarità della catena C, deselezionate Ribbon e rappresentate la proteina con sfere (colonna C), quindi coloratela (colonna Cl) scegliendo cpk e poi By polarity (David Godsell).
Otterrete l'immagine di figura 18 dove si vede che la zona centrale della catena (quella immersa nella membrana) è relativamente apolare (colori tenui), mentre l'estremità in alto e la porzione in basso (che sporgono dalla membrana) sono molto più polari, infatti abbondano amminoacidi basici (con sfere blu) e acidi (con sfere rosse).





Si arriva alla stessa conclusione rappresentando la catena C con la Superficie Molecolare (colonna MS) e poi colorandola (colonna Cl) scegliendo cpk e poi By polarity (David Godsell). Si ottiene l'immagine di figura 19.




fig. 20


fig. 21


fig. 22









figura 23

Struttura Quaternaria

Le proteine composte da più catene (subunità) possiedono una struttura quaternaria cioè una struttura tridimensionale complessiva delle subunità che descrive come queste si incastrano una nell'altra per formare una struttura proteica funzionale.
Una proteina con struttura quaternaria può essere paragonata ad un motore che è composto da diverse parti che devono essere incastrate insieme correttamente per poter funzionare.
Il recettore dell'acetilcolina è una proteina con struttura quaternaria formata da cinque subunità.
Scaricate il file 1uv6.pdb che contiene la proteina completa e mettetelo nella cartella Acetilcolina.
Chiudete e riaprite MGL Tools.
Aprite 1uv6.pdb e eliminate le molecole di acqua con Edit / Delete water.
Deselezionate la rappresentazione a linee (colonna L) e selezionate la rappresentazione Ribbon (colonna R). Colorate il nastro (colonna Cl) con l'opzione By Secondary Structure. Aggiustate il valore minimo di fog nel menù Tools ad un valore un pò sotto quello massimo e otterrete l'immagine mostrata in figura 20.


Per differenziare le 5 catene e mettere in evidenza i due legandi (carbammilcolina), procedete così:
Su 1uv6.pdb Colorate il nastro (colonna Cl) con l'opzione By Chain.
Aprite l'elenco dei residui della catena C, andate sul legando CCE-1206 e selezionate la rappresentazione a sfere (colonna C).
Aprite l'elenco dei residui della catena D, andate sul legando CCE-1206 e selezionate la rappresentazione a sfere (colonna C).
Otterrete l'immagine mostrata in figura 21.





Questo recettore dell'acetilcolina si trova legato ai due legandi e quindi è nella conformazione col poro aperto. Per valutare meglio le dimensioni e la polarità del poro potete rappresentare la superficie molecolare della proteina colorata in base alla polarità.
Togliete la rappresentazione Ribbon alle cinque catene A, B, C, D, E una per una.
Su 1uv6.pdb cliccate la rappresentazione della Superficie Molecolare (colonna MS) e poi coloratela (colonna Cl) scegliendo MSMS-Mol e poi By polarity (David Godsell).
Si ottiene l'immagine di figura 22.



Notate che la porzione esterna del poro è abbastanza apolare, cioè è colorata con colori più tenui, mentre l'imboccatura e l'interno del poro sono zone ricche di amminoacidi basici (blu) e acidi (rossi) come si vede nella figura 23 qui sotto. Nel pori, infatti devono transitare ioni sodio.


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Autore: prof Mauro Tonellato






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