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Chimica.it

Responsabile:
Prof. Mauro Tonellato
MODELLISTICA MOLECOLARE CON MGL TOOLS

PROTEINE E LEGANDI
   


Lezioni con
MGL Tools / AutoDock

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Proteine e Legandi
Docking su COX2
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Le proteine sono macromolecole molto complesse, la loro struttura può essere capita più facilmente con un programma di modellistica molecolare come MGL Tools. Questo programma mostra il modello tridimensionale della proteina nello schermo del computer e consente di esaminarlo e manipolarlo come se fosse un oggetto nelle nostre mani. Questo non solo ci aiuta a capire meglio il significato di struttura primaria, secondaria, terziaria e quaternaria delle proteine, ma ci permette di comprendere meglio anche altre proprietà delle proteine, come l'interazione legando - sito attivo negli enzimi o l'azione degli inibitori.
Questa lezione può essere affrontata in due modi.
1) Online. Potete leggere le istruzioni ed eseguirle passo passo al computer con MGL Tools, aiutandovi con le illustrazioni che chiariscono ogni passaggio.
2) In aula informatica con la classe. Se siete insegnanti di chimica, potete adattare la lezione alle esigenze della vostra classe e proporla in aula informatica ai vostri allievi.
La durata di questa lezione è di circa un'ora.
N.B. Cliccando sulle figure potrete vedere le immagini a pieno schermo.

Gli argomenti di questa lezione sono:
-- Legando e sito di legame in una proteina
-- Analisi delle interazioni tra legando e sito di legame


Recettore dell'acetilcolina

Anche in questa seconda lezione sulle proteine, studieremo il recettore dell'acetilcolina, ma, invece della proteina completa (mostrata in figura 1) formata da 5 catene, useremo 1uv6_tut (figura 2) che contiene solo le catene C e D, e che abbiamo già usato nella lezione precedente. In questa struttura, al posto dell'acetilcolina, è presente un suo analogo, carbammilcolina, che si lega in modo più stabile nella proteina e così proteina e legando possono essere cristallizzati insieme.
Il recettore dell'acetilcolina si trova sulla superficie delle cellule muscolari nelle sinapsi nervo-muscolo. Quando l'impulso nervoso arriva alla fine del neurone, questo rilascia un getto di neurotrasmettitori come l'acetilcolina, che giunge alla cellula muscolare e si lega a specifici recettori il cui poro centrale si apre e lascia entrare un flusso di ioni sodio che innesca la contrazione muscolare. Questi recettori svolgono un ruolo molto delicato perchè, se vengono paralizzati nella forma aperta, costringono i muscoli a rimanere contratti per un tempo indefinito provocando un irrigidimento incontrollato che può portare alla morte. Alcuni veleni tra i più pericolosi, come il veleno del cobra e il veleno della conchiglia a cono, attaccano proprio il recettore dell'acetilcolina.


Aprire il file PDB
Scaricate il file 1uv6_tut.pdb e collocatelo in una cartella che chiamerete Acetilcolina nella root directory c:\.
Lanciate MGL Tools e cliccate File / Preferences / Set per aprire una finestra di dialogo, quindi scrivete in Startup Directory la posizione della cartella Acetilcolina, c:\Acetilcolina.
In MGL Tools cliccate File / Read Molecule e aprite il file 1uv6_tut.pdb.



1uv6 - fig. 1


1uv6_tut - fig. 2




fig. 3


fig. 4






figura 5




















figura 5b












Legando

Deselezionate la rappresentazione linee (colonna L) per 1uv6_tut e scegliete Ribbon (colonna R).
Colorate la struttura secondaria di 1uv6_tut (colonna Cl) By Chain.
Cliccate sul triangolino azzurro accanto a 1uv6_tut per vedere le subunità di cui è composto (C e D)
Cliccate sul triangolino azzurro accanto alla catena C e scorrete i residui verso il basso fino ad incontrare il legando CCE-1206 (carbammilcolina).
Cliccate su questa e scegliete la rappresentazione con sfere (colonna C) e poi coloratela (colonna Cl) scegliendo cpk e poi By atom type. Otterrete le immagini di figura 3 e figura 4 dove si vede che il legando è contenuto in una tasca formata da due avvolgimenti che sporgono dalla catena C (a sinistra) e dalla parete beta pieghe della colonna D (a destra).
Per vedere meglio il legando selezionate CCE-1206 e salvatelo come CCE.pdb.
Cliccate col pulsante destro su 1uv6_tut e scegliete Delete per cancellare tutto.
Aprite ora CCE.pdb.
Scegliete la rappresentazione Balls and Sticks e coloratela balls, sticks, By atom type.
Aggiungete gli idrogeni con Edit / Hydrogens / Add , OK.
Regolate il valore minimo di fog in Tools intorno a 11, un poco sotto il valore massimo.
Otterrete l'immagine mostrata qui sotto (figura 5).



Come si vede qui sopra in figura 6, la carbammilcolina è leggermente più polare dell'acetilcolina (ha un NH
2 al posto di un CH3) e questo le consente di legarsi con più forza nel sito di legame e di rimanere nella proteina anche durante la cristallizzazione. Ricordiamo che queste strutture si ottengono dalla diffrazione dei raggi X su cristalli di proteine.
Per valutare come il legando è alloggiato nel sito di legame, bisogna analizzare il sito di legame della proteina.










fig. 6


fig. 6a





















figura 7






Sito di legame

Il sito di legame è costituito da tutti gli amminoacidi che circondano il legando.
Chiudete e riaprite MGL Tools.
Aprite 1uv6_tut, selezionate CCE-1206 nella catena C ed eliminatelo con Edit / Delete / Delete Selected Atoms.
Salvate la la proteina senza il legando con il nome 1uv6_pep.
Cancellate 1uv6_tut e aprite 1uv6_pep.
Aprite anche CCE.pdb, ora avete proteina e legando in due molecole distinte.
Aggiungete gli idrogeni: Edit / Hydrogens / Add.
Lasciate visibili solo gli idrogeni polari: Edit / Hydrogens / Merge Non-Polar.
Rappresentando il legando con Sfere e la proteina con Balls and Sticks di vede che il legando è circondato da una selva di amminoacidi come è mostrato in figura 6.

Selezionate gli amminoacidi del sito di legame con questa procedura:
Selezionate CCE (colonna S)
Premete Select / Spherical Region e, nella finestra di dialogo, aumentate il raggio a 5.5 A, cliccate poi current selection / select / close.
Quindi cliccate Select / Set Selection Level / Residue.
Vedrete gli amminoacidi attorno al legando selezionati con crocette gialle.
Cliccate Select / Invert Selection per invertire la selezione e Edit / Delete / Delete Selected Atoms per eliminare tutti gli amminoacidi più lontani. Otterrete l'immagine di figura 6a.

Selezionate 1uv6_pep
e salvate col nome 1uv6_sito, dato che contiene solo gli amminoacidi del sito di legame: 8 amminoacidi della catena C e 7 amminoacidi della catena D..
Potete anche continuare con gli amminoacidi che avete sullo schermo, ma se avrete problemi potete ricaricare 1uv6_sito.
Cliccate Hydrogen Bonds / Build / Set Parms+Build, e si ottengono tre legami idrogeno
quindi cliccate Hydrogen Bonds / Display / As Spheres.
Otterrete l'immagine qui sotto (figura 7).

Il legando è stato reso più visibile colorandolo con l'opzione balls, sticks, Carbon only, Custom color e poi scegliendo il verde chiaro dalla tavolozza.
Osservate che la zona destra del legando, che contiene il gruppo ammonio positivo RN+(CH3)3, è circondata, sulla destra e sopra, da tre tirosine (aromatiche, negative a pH neutro) e in basso e verso di noi, da due triptofani (aromatici, apolari).
Il lato sinistro del legando, che contiene un estere e un'ammide (polare) è circondato da amminoacidi impegnati nei tre legami idrogeno, che formano quindi una zona polare.

Le interazioni legando - sito di legame, si possono analizzare meglio di così usando appositi programmi come AutoDock Vina. Nello stesso modo si può anche studiare l'interazione con un legando diverso da quello presente nella proteina cristallizzata.
I programmi che cercano di posizionare un legando nel sito di legame di una proteina si chiamano programmi di docking molecolare (docking = mandare in porto).
Nella prossima lezione proveremo a fare il docking di un farmaco antiinfiammatorio, ibuprofene, nella sua proteina bersaglio, COX2.

 



Autore: prof Mauro Tonellato

 



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