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Responsabile:
Prof. Mauro Tonellato


MODELLISTICA MOLECOLARE
Docking Molecolare con AutoDock Vina

PROGETTARE NUOVI FARMACI

   


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Docking Molecolare significa letteralmente mandare in porto una molecola, si tratta di una simulazione al computer che calcola la posizione più conveniente che un legando (una piccola molecola organica) può assumere all'interno del sito attivo di un enzima. Se il legando non è quello naturale dell'enzima, si comporta come un inibitore competitivo e blocca temporaneamente l'attività dell'enzima. Questa tecnica è utilizzata per progettare al computer nuovi farmaci.
Oggi il programma più usato per fare Docking Molecolare è AutoDock Vina (un programma gratuito, open source, creato dal Dr. Oleg Trott del The Scripps Research Institute) che ha raggiunto la velocità e l'affidabilità di altri costosi programmi commerciali.
Per fare docking molecolare con AutoDock Vina non servono attrezzature professionali, basta un normale PC e seguire la procedura mostrata qui sotto.
Se siete insegnanti di chimica, potreste proporre ai vostri studenti un'esperienza pratica di docking molecolare nel laboratorio di informatica della scuola.
I software da scaricare sono i seguenti:
AutoDock Vina http://vina.scripps.edu/download.html (esegue il docking molecolare)
AutoDock Tools http://mgltools.scripps.edu/downloads (interfaccia grafica per preparare proteina e legando e per valutare i risultati)
Avogadro http://avogadro.cc/wiki/Main_Page (crea nuove molecole da usare come legandi)



COX2, cicloossigenasi 2, è l'enzima che trasforma l'acido arachidonico in prostaglandine mediatrici del dolore e dell'infiammazione, è il bersaglio dei FANS, farmaci antiinfiammatori non steroidei, tra i quali, i più famosi sono aspirina e ibuprofene.
Celecoxib è un farmaco antiinfiammatorio di nuova generazione.

In questa lezione cercheremo di capire come si progettano nuovi farmaci
Cominceremo esaminando i risultati del
docking di celecoxib all'interno dell'enzima COX2 fatto nella lezione precedente.
Useremo Avogadro per creare nuove molecole da sottoporre al docking
Faremo il docking molecolare su COX2 di tutti i farmaci creati
Esamineremo i risultati dei docking per valutare la bontà dei nuovi farmaci



Questa lezione è stata preparata con la collaborazione di due allievi di 4i che, nel laboratorio di informatica della scuola, hanno fatto decine di docking di molecole che loro stessi hanno progettato e realizzato con Avogadro:
Marco Benin e Filippo Pescarolo (4i, anno scolastico 2016-2017)

N.B. Cliccando sulle immagini qui sotto potrete vederle ingrandite.














































fig.1




























fig.2





















fig.3







































































































fig.4



















Software necessario

=> Assicuratevi di aver installato i tre programmi.AutoDock_Vina, MglTools, Avogadro.
=> Copiate in C:\ la directory COX2N che sarà la directory di lavolo di questa lezione: contiene la proteina 3LN.pdbqt, il legando CEL.pdb, il file config_3LN_CEL.txt, il docking di celecoxib, 3LN_CEL_vina.pdbqt, e gli amminoacidi AA.pdb che circondano il legando nella tasca di legame.
=> Naturalmente dovete aver già svolto la lezione precedente Docking_su_COX2 perchè molte procedure saranno date per scontate.


Ottimizzare CEL con Avogadro
Per rendere più credibile il confronto tra i vari farmaci, conviene che tutte le molecole da sottoporre al docking siano ottimizzate nello stesso modo, con Avogadro.

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1) Ottimizzate CEL.pdb con Avogadro
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> > > Aprite con Avogadro il file CEL.pdb che si trova in COX2N ---


> > > Aggiungete gli idrogeni ---
Build => Add hydrogens => ok

> > > Ottimizzate la geometria ---
Cliccate su E (auto optimzation tool) => nel campo Force Field scegliete MMFF94S => start
Quando il programma ha raggiunto un minimo di energia (dE < 10
-8 kJ/mol) l'operazione si arresta.
In questo caso l'energia ottenuta è E = 251.266 kJ/mol (Fig.1).
Cliccate stop per disattivare la ricerca del minimo di energia.



> > > Salvate il legando ottimizzato col nome CELA.pdb in COX2N ---

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2) Correggete il nome del legando all'interno del file pdb usando la sigla LIG 1 di Avogadro
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Aprite CELA.pdb con notepad e osservate che ogni atomo è descritto da una riga di dati (Fig.2)



Sostituite su tutti gli atomi il nome del legando "CEL A 682"
con la sigla standard di Avogadro: "LIG 1".
Fate attenzione: la nuova stringa deve iniziare e finire esattamente dove inizia e finisce la vecchia in modo da non alterare le altre colonne di numeri:
scrivete LIG sopra CEL, poi, dopo 5 spazi vuoti, scrivete 1 sopra il 2 finale come si vede nella figura seguente (Fig.3).
Usate la funzione copia/incolla per fare più in fretta (Ctrl C / Ctrl V)



> > > Salvate il legando ottimizzato e corretto col nome CELAA.pdb in COX2N ---



Docking di CELAA.pdb

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1) Preparate il legando CELAA.pdbqt
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> > > Lanciate AutoDockTools partendo dall'icona sul desktop ---

> > > Impostate la directory COX2N come directory di default in AutoDockTools ---
File => Preferences => Set
In Startup Directory scrivete => C:\COX2N premete Make Default => Set => Dismiss

> > > Aprite il legando CELAA.pdb in Autodock ---
Pulsante destro su All Molecules => Read Molecule scegliete CELAA.pdb => Apri.

> > > Aggiungete gli atomi di idrogeno a CELAA ---
Edit => Hydrogens => Add => OK

> > > Scegliete CELAA come legando ---
Ligand => Input => Choose => CEL => Select Molecule for AutoDock 4 => OK

> > > Salvate il legando in formato pdbqt --
Ligand => Output => Save as PDBQT => CELAA.pdbqt => Salva

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2) Scrivete il file config.txt dedicato
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Usando notepad correggete il file config_3LN_CEL.txt scrivendo CELAA al posto di CEL
Oppure copiate e incollate in notepad le seguenti righe:

receptor = 3LN.pdbqt
ligand = CELAA.pdbqt
center_x = 30.1
center_y = -22.6
center_z = -15.8
size_x = 32
size_y = 24
size_z = 24
out = 3LN_CELAA_vina.pdbqt

Salvate il file in COX2N col nome config_3LN_CELAA.txt

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3) Lanciate il docking
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

> > > Verificate che in C:/COX2N siano presenti i seguenti file ---
3LN.pdbqt
CELAA.pdbqt
config_3LN_CELAA.txt
vina.exe


> > > Lanciate il docking ---
Cliccate Run => Run AutoDock Vina
in Vina Program Pathname cliccate => Browse => vina.exe => Apri
In Config Filename cliccate => Browse => config_3LN_CELAA.txt => Apri => Launch


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4) Valutare i risultati del docking
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> > > Aprite il file che contiene i risultati del docking di CELAA ---
Analize => Dockings => Open AutoDock Vina Results => 3LN_CELAA_vina.pdbqt => Apri => Single molecule whith multiple conformations => OK

> > > Aprite il file che contiene i risultati del docking di CEL fatto la lezione precedente ---
Analize => Dockings => Open AutoDock Vina Results => 3LN_CEL_vina.pdbqt

> > > Colorate le due molecole come nella figura qui sotto (fig.4) ---

Su 3LN_CELAA_vina => cerchietto B (Sticks and Balls)
colonna Cl => Balls, Sticks, Carbon only => Custom color (arancione)
Su 3LN_CEL_vina => cerchietto B => poi coloratelo di verde
inoltre colorate d verde anche il punteggio
colonna Cl => Protein Labels => Custom Color (verde)
Se l'immagine è un po' scura, alzate il valore di inizio di fog nella finestra Tools.



La posa calcolata da AutoDock per il legando prodotto da Avogadro CELAA (arancione) è quasi sovrapposta alla posa calcolata nella lezione precedente per il legando originale CEL (verde).
Notate, però, che il punteggio del docking è lievemente inferiore:
-12.4 kcal/mol usando CEL generato da Avogadro (CELAA, arancione),
-12.5 kcal/mol usando CEL ottenuto dalla cristallografia (CEL, verde).
Questi due valori sono così vicini che confermano l'affidabilità di Avogadro nel creare molecole ben ottimizzate da usare nel docking.
In ogni modo, il valore di riferimento per valutare la bontà dei prossimi docking che faremo in questa lezione, sarà -12.4 kcal/mol perchè creeremo ogni farmaco con Avogadro.

> > > Salvate la posa di CEL col nome CEL_posa.pdb ---
Select (quadratino S) 3LN_CEL_vina (-12.5) => Save => Write PDB => scrivete CEL_posa => OK















fig.5


















































Fig.6































































































fig.7



































fig. 8















Prima variante


Per cominciare introduciamo in celecoxib, al posto del gruppo CF
3, un gruppo di acido propanoico con configurazione S come quello che c'è nell'ibuprofene. Nella scorsa lezione, infatti, abbiamo osservato che il carbossile dell'ibuprofene interagisce con una arginina in COX2.


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1) Preparate con Avogadro il legando CELP.pdb
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> > > Aprite con Avogadro il file CELAA.pdb che si trova in COX2N ---


> > > Modificate il gruppo CF
3 in acido propanoico (S) ---
Cliccate sulla matita (Draw Tool)
Con un click del pulsante destro cancellate il fluoro verso di voi, (verrà sostituito da un idrogeno)
Togliete la spunta su Adjust Hydrogens
Su Element scegliete carbonio
Fate un click sugli altri due fluori per trasformarli entrambi in carboni
Scegliete quale dei due carboni deve diventare COOH per dare una configurazione (S)
In figura 6: dato che H è verso di noi, ci deve essere rotazione verso destra di COOH, anello, CH
3
Attenzione, per muovere la molecola dovete uscire dalla modalità Draw Tool cliccando sulla stellina blu (navigation Tool) poi tornate su Draw per continuare a costruire la molecola.
Su Element scegliete ossigeno
Legate un ossigeno al carbonio che avete scelto con un click-trascina-rilascia
Scegliete doppio legame
Legate un ossigeno con doppio legame al carbonio con un click-trascina-rilascia. (il doppio legame si può creare anche con un clic sul legame singolo)
Otterrete l'immagine qui sotto (fig.6). Notate che le lunghezze dei legami sono errate e mancano idrogeni



> > > Aggiungete gli idrogeni ---
Build => Add hydrogens => ok

> > > Ottimizzate la geometria ---
Cliccate su E (auto optimzation tool) => nel campo Force Field scegliete MMFF94S => start
Quando ha raggiunto un minimo di energia, cliccate su stop.

> > > Salvate la molecola in COX2N col nome CELP.pdb---

> > > Verificate con notepad che il nome del ligando in CELP.pdb sia sempre LIG 1 ---

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2) Preparate il legando CELP.pdbqt
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> > > Aprite il legando CELP.pdb in Autodock ---
> > > Aggiungete gli atomi di idrogeno a CELP ---
> > > Scegliete CELP come legando ---
> > > Salvate il legando in formato pdbqt --

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3) Scrivete il file config.txt dedicato
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

receptor = 3LN.pdbqt
ligand = CELP.pdbqt
center_x = 30.1
center_y = -22.6
center_z = -15.8
size_x = 32
size_y = 24
size_z = 24
out = 3LN_CELP_vina.pdbqt

Salvate il file col nome config_3LN_CELP.txt

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4) Lanciate il docking
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> > > Verificate che in C:/COX2N siano presenti i seguenti file ---
3LN.pdbqt
CELP.pdbqt
config_3LN_CELP.txt
vina.exe


> > > Lanciate il docking ---

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5) Valutate i risultati del docking
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> > > Caricate il file che contiene i risultati del docking ---
Analize => Dockings => Open AutoDock Vina Results => 3LN_CELP_vina.pdbqt => Apri => Single molecule whith multiple conformations => OK

> > > Caricate il file CEL_posa.pdbqt che serve da confronto ---

Nell'immagine qui sotto (fig.7) si vede che CELP si è collocato nel sito di legame di COX2 nello stesso modo del legando originale. Verso l'alto si vede che il carbossile è rivolto verso l'arginina sul retro della tasca (come ibuprofene), ma ha avuto un punteggio di docking leggermente inferiore: -12.2 kcal/mol (contro -12.4)
Questa differenza di punteggio va presa con prudenza perchè i fattori che influenzano l'interazione legando-enzima sono più complessi di quelli considerati da AutoDock. Quindi possiamo concludere che questa variante di celecoxib con acido propanoico (come ibuprofene) potrebbe essere un ottimo farmaco antiinfiammatorio e avrebbe il pregio di non contenere fluoro.



Nella figura qui sotto (fig.8) abbiamo rappresentato il nuovo legando CELP circondato dagli amminoacidi della tasca di legame AA.pdb. Si vede molto bene l'interazione tra il carbossile di CELP (a destra in alto) e i gruppi amminici dell'arginina (sul davanti, blu) e il gruppo OH (rosso) della tirosina (beige, in centro).
















fig. 9





































fig.10













































































fig.11

































fig.12

















Seconda variante


Proviamo ora ad introdurre una modifica nell'anello benzenico in basso di celecoxib, attorno al quale avevamo osservato, nella tasca di legame, uno spazio disponibile in una zona sostanzialmente apolare.
Introduciamo un sostituente CH
3 (apolare) come mostrato nella figura qui sotto (fig.9) con lo scopo di riempire meglio questa zona della tasca. Chiameremo questa nuova molecola CELC.



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1) Preparate con Avogadro la molecola CELC.pdb
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> > > Aprite con Avogadro il file CELAA.pdb che si trova in COX2N ---

> > > Introducete un gruppo CH
3 nella posizione in basso a sinistra dell'anello benzenico---
> > > Aggiungete gli idrogeni ---
> > > Ottimizzate la geometria ---
> > > Salvate la molecola in COX2N col nome CELC.pdb---
> > > Verificate con notepad che il nome del ligando in CELC.pdb sia sempre LIG 1 ---

Otterrete la molecola della figura seguente (fig.10)



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2) Preparate il legando CELC.pdbqt
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

> > > Aprite la molecola CELC.pdb in Autodock ---
> > > Scegliete CELC come legando ---
> > > Salvate il legando in formato pdbqt --

>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
3) Scrivete il file config.txt dedicato
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

receptor = 3LN.pdbqt
ligand = CELC.pdbqt
center_x = 30.1
center_y = -22.6
center_z = -15.8
size_x = 32
size_y = 24
size_z = 24
out = 3LN_CELC_vina.pdbqt

Salvate il file col nome config_3LN_CELC.txt

>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
4) Lanciate il docking
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

> > > Verificate che in C:/COX2N siano presenti i seguenti file ---
3LN.pdbqt
CELC.pdbqt
config_3LN_CELC.txt
vina.exe


> > > Lanciate il docking ---

>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
5) Valutate i risultati del docking
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>

> > > Caricate il file che contiene i risultati del docking di CELC (su Analyze...) ---
> > > Caricate il file CEL_posa.pdbqt che serve da confronto ---

Nella figura seguente si vede la posa di CELC arancione contro quella di CEL (verde).
Il punteggio -12.9 kcal/mol significa che la posa è molto buona, ha guadagnato 0.5 kcal/mol per l'interazione del gruppo CH
3 con una parte sostanzialmente apolare della tasca.



Nell'immagine qui sotto (fig.12) si vede che il nuovo gruppo CH
3 di CELC (in basso a sinistra), è relativamente vicino a due gruppi OH di una serina (arancione a sinistra) e di una tirosina (beige in basso).
Se mettete un gruppo NH
2 (invece del CH3) il punteggio di docking peggiora (-12.5 kcal/mol).
Se mettete un gruppo OH (invece del CH
3) il punteggio di docking peggiora ancora (-12.3 kcal/mol).



Nulla si può dire sulle vere potenzialità di questa seconda variante di celecoxib (CELC), ma, stando al punteggio del docking (-12.9 kcal/mol), questa molecola sembra molto promettente come farmaco antiinfiammatorio.













fig.13


























fig. 14

Terza e quarta variante

A questo punto potete provare tutte le varianti che vi vengono in mente. Gli allievi di 4i che hanno affrontato questo problema hanno lavorato per più giornate al computer. Una delle varianti più semplici che ha dato ottimi risultati nel docking è stata le seguente CELCXF:



Questa variante ha dato un punteggio di docking -13.1 kcal/mol come si vede nella seguente figura e il farmaco CELCXF (arancione) si è collocato lievemente più in alto rispetto a CEL (verde).




















fig. 15


Il punteggio di docking può essere ulteriormente migliorato.
Per esempio, trasformando il CH3 in basso in CF3, si ottiene un punteggio di -13.3 kcal/mol, come si vede nella figura qui sotto (Fig15). Il farmaco si è collocato ancora più in alto nella tasca a causa dell'ingombro sterico del nuovo gruppo CF3.



Naturalmente un nuovo CF3 appesantisce la molecola, complica la sintesi del farmaco e pone nuovi problemi di metaboliti nel corpo.

Il lavoro è solo cominciato, sperimentate in prima persona, provate a introdurre nuovi sostituenti o anche a cambiare la logica degli anelli e confrontate i vostri risultati con quelli proposti qui. Riuscite a trovare varianti con punteggio ancora migliore?

Autore: prof Mauro Tonellato







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