Pianeta
Chimica.it

Responsabile:
Prof. Mauro Tonellato

MODELLISTICA MOLECOLARE
14^ LEZIONE


AutoDock Vina Tutorial
Docking Molecolare
   


Lezioni con ArgusLab:
1^ 1-butene e 2-butene
2^ Carbocatione 1° e 2°
3^ Acetone e tautomeria
4^ Dieni coniugati pdf
5^ Benzene e aromaticità pdf
6^ Legame covalente
7^ Conformazione alcani
8^ Struttura delle proteine
9^ Legandi e Siti di legame
10^ Docking molecolare
11^ Ponte Cloronio
12^ Diels-Alder
13^ Enolo mono e disostituito
14^ Docking Molecolare
con AutoDockV
ina

Chimica al Computer


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Docking Molecolare: mandare in porto una molecola, riferito al riconoscimento reciproco tra un legando (una piccola molecola organica) e il suo bersaglio proteico (sito attivo dell'enzima). Tecnica utilizzata per progettare nuovi farmaci
In questi ultimi anni il software libero (open source) si è molto evoluto e, anche se non ha raggiunto la raffinatezza delle produzioni commerciali, è diventato così affidabile che sempre più ricercatori nel mondo lo usano per realizzare i loro studi.
Oggi il programma più usato al mondo per fare Docking Molecolare è AutoDock (open source) che con la sua ultima variante AutoDock Vina è diventato ancora più veloce e accurato (elaborato da Dr. Oleg Trott del The Scripps Research Institute).
Anche voi potete realizzare un docking molecolare nel laboratorio di informatica della vostra scuola e ottenere in pochi minuti risultati professionali.
I software da scaricare sono i seguenti:
AutoDock Vina http://vina.scripps.edu/download.html (per fare il docking molecolare)
AutoDock Tools http://mgltools.scripps.edu/downloads (interfaccia grafica per preparare proteina e legando e per valutare i risultati)
Avogadro http://avogadro.cc/wiki/Main_Page (per preparare varianti del legando originale)



Per cominciare posizioneremo il farmaco indinavir all'interno dell'enzima HIV proteasi. Confronteremo la posizione calcolata da AutoDock Vina con la posizione reale che questo farmaco assume nell'enzima ricavata dal file 1HSG.pdb, ottenuto da un cristallo di HIV proteasi legata a indinavir. In questo modo potremo verificare l'accuratezza del docking molecolare di AutoDock Vina.
Poi faremo il docking di altri farmaci antivirali nello stesso enzima per capire quale sia il migliore.
Per finire progetteremo un nuovo farmaco anti HIV e lo confronteremo con i farmaci commerciali



Gli argomenti di questa lezione sono:
-- Installazione del software
-- Preparazione dei file pdb della proteina e del legando
-- Preparazione dei file pdbqt della proteina e del legando
-- Individuazione del sito di legame e scrittura del file config.txt
-- Docking
-- Valutazione dei risultati
N.B. Cliccando sulle immagini qui sotto potrete vederle a pieno schermo













































































Fig.1





















fig. 2




fig. 3











Installare il software
Scaricate i file indicati sopra e avrete i tre file seguenti:
autodock_vina_1_1_2_win32.msi
mgltools_win32_1.5.6_Setup.exe
Avogadro-1.1.1-win32.exe
Installate i tre programmi.
Scaricate la directory HIV che contiene i file PDB per questa lezione
HIV.zip
La directory HIV deve essere decompressa nel disco C in modo da avere il percorso C:/HIV
Il file Vina.exe che si trova nella directory
Programmi/The Scripps Research Institute

deve essere copiato nella directory C:/HIV/1HSG che diventerà la nostra directory di lavoro


Preparare i file pdb della proteina e del legando

In HIV/PDB originali ci sono cinque file PDB dell'enzima HIV proteasi legato a cinque diversi farmaci antivirali
1HSG.pdb ----------> HIV + indinavir
1HXB.pdb ----------> HIV + saquinavir
1HXW.pdb ----------> HIV + ritonavir
1OHR.pdb ----------> HIV + nelfinavir
3AID.pdb ------------> HIV + amminimide peptide isostere

A partire dal file 1HSG.pdb che contiene l'enzima HIV proteasi legato ad indinavir, dovete ottenere due file distinti, uno contenente solo la proteina che chiamerete p1HSG.pdb e l'altro contenente solo il legando che chiamerete MK.pdb.

=== 1) Copiate 1HSG.pdb nella directory di lavoro C:/HIV/1HSG ==========

=== 2) Estraete il legando indinavir e salvatelo come MK.pdb =========

--- Lanciate AutoDockTools partendo dall'icona sul desktop ---

--- Impostate la directory di lavoro 1HSG come directory di default in AutoDockTools ---
Cliccate File => Preferences => Set
In Startup Directory scrivete => C:\HIV\1HSG premete Make Default e Set => Dismiss

--- Aprite la proteina 1HSG.pdb ---
Pulsante destro
su All Molecules => Read Molecule
in C:/HIV/1HSG scegliete 1HSG.pdb => Apri e otterrete la schermata in figura 1.


--- Individuate il legando indinavir che qui è chiamato MK ---
Nella finestra di sinistra cliccate sul triangolino a sinistra di 1HSG e appaiono le due catene A e B. Cliccate sul triangolino a fianco della catena B e si apre la sequenza dei residui che contiene (fig.2)
Scorrete fino alle fine degli amminoacidi e vedrete il residuo MK1 902. cliccate sul primo quadratino a destra di MK1 902 (colonna S cioè select) e vedrete che gli atomi del legando MK si evidenziano in giallo come in fig.3.

--- Salvate MK.pdb ---
Cliccate File => Save => Write PDB
scrivete al posto del nome del file corrente (1HSG) il nome del legando MK
c:\HIV\1HSG\MK.pdb => OK

=== 3) Salvate la proteina senza legando col mome p1HSG.pdb =========

--- Eliminate il legando ---
Mentre il legando è ancora selezionato (giallo) cliccate su Edit => Delete => Delete Selected Atoms

--- Salvate la proteina senza legando col nome p1HSG:pdb ---
Cliccate File => Save => Write PDB
scrivete al posto del nome del file corrente (1HSG) il nome della proteina senza legando p1HSG
c:\HIV\1HSG\p1HSG.pdb => OK

--- Cancellate ora la proteina dallo schermo ---
Pulsante destro su 1HSG nella finestra di sinistra => Delete















fig. 4






fig. 5






























Fig.6


































fig. 7




Preparare i file pdbqt della proteina e del legando

I file pdb contengono informazioni sulla posizione nello spazio dei vari atomi di una molecola. Per realizzare il docking AutoDock Vina ha bisogno di informazioni supplementari come la carica parziale, la posizione degli idrogeni polari, i legami che possono ruotare nel legando, ecc.
Queste informazioni vengono scritte in un nuovo file con formato pdbqt.

=== 1) Eliminate le molecole d'acqua, aggiungete gli idrogeni e salvate proteina.pdbqt =======

--- Aprite la proteina p1HSG.pdb ---
Pulsante destro
su All Molecules => Read Molecule scegliete p1HSG.pdb => Apri.

--- Colorate la molecola secondo il tipo di atomo ---
Cliccate sull'ultimo triangolino a destra accanto a p1HSG.pdb (colonna Cl, menù Coloring)
scegliete color By atom type (C grigio, O rosso, N blu, S giallo)

--- Eliminate le molecole d'acqua ---
Select => Select from string compare una finestra (fig.4) in cui dovete digitare:
Residue => HOH* (HOH asterisco = tutte le molecole di acqua)
Atom => *
Add => Dismiss e tutte le molecole d'acqua appaiono gialle (selezionate)
Edit => Delete => Delete Selected Atoms => Continue

--- Aggiungete ora gli atomi di idrogeno ---
Edit => Hydrogens => Add => OK

---Salvate la proteina in formato pdbqt ---
Cliccate Grid => Macromolecule => Choose => p1HSG => Select Molecule => OK (fig.5)
compare una finestra che dice che sono stati trovati 1282 idrogeni non polari che sono stati nascosti (merged). Ora restano solo gli idrogeni polari, quelli capaci di fare legami idrogeno.
=> OK (fig.6)
Il programma chiede di salvare la proteina così modificata come p1HSG.pdbqt => OK



=== 2) Aggiungete gli idrogeni, determinate il numero di torsioni e salvate legando.pdbqt =======

--- Aprite il legando MK.pdb ---
Pulsante destro
su All Molecules => Read Molecule scegliete MK.pdb => Apri.

--- Nascondete la proteina ---
Cliccate sul cerchietto rosa accanto a p1HSG per deselezionare l'opzione L (mostra la molecola con linee) e la proteina diventerà invisibile

--- Centrate la visuale sul legando cliccando l'icona mirino (sotto edit) ---

--- Aggiungete gli atomi di idrogeno a MK ---
selezionate MK cliccando sul quadratino a fianco di MK nella colonna S
Edit => Hydrogens => Add => OK
Cliccate Ligand => Input => Choose => MK => Select Molecule for AutoDock 4 => OK
Il programma ha individuato 43 idrogeni non polari e li ha nascosti lasciando visibili solo quelli polari, 17 carboni aromatici, 16 legami ruotabili e ne ha scelti 14 scartando i due legami ammidici che sono difficilmente ruotabili a causa della risonanza (fig.7)

-- Salvate il legando in formato pdbqt --
Ligand => Output => Save as PDBQT => MK.pdbqt => Salva






fig. 8




fig. 9




fig. 10





















fig. 11

Individuare il sito di legame e scrivere il file config.txt

La zona della proteina dentro alla quale AutoDock Vina cerca di fare il docking è delimitata da un cubo colorato chiamato GridBox. Il sito di legame deve essere tutto contenuto all'interno della GridBox.

=== 1) Determinate posizione e dimensioni della GridBox ========================

--- Rendete il legando ben visibile (verde) per centrare più facilmente la GridBox su di lui ---
A fianco della proteina p1HSB cliccate il cerchietto L (lines)
A fianco del legando MK deselezionate il cerchietto L e scegliete il cerchietto B (Sticks and Balls)
Nel triangolo Cl (color)
scegliete => By residue type (fig.8)

--- Centrate la visuale cliccando l'icona mirino (sotto edit) ---

--- Scegliete la macromolecola e il legando ---
Grid => Macromolecule => Choose => p1HSG.pdbqt => Select Molecule => OK
Grid => Set Map Types => Ligand => Choose ligand => MK.pdbqt => Select ligand

In generale dovte centrare la GridBox manualmente spostandola con le tre rotelle rossa verde e blu fino a quando il suo centro (crocetta gialla) è nel centro del sito di legame.
In questo caso il sito di legame dell'enzima è facilmente individuabile dato che 1HSG.pdb conteneva il legando al proprio interno. Per centrare il sito di legame in p1HSG è sufficiente centrare la GridBox sul legando.

--- Centrate la GridBox sul legando ---
Grid Box => Center => Center on ligand
Vedrete un cubo colorato centrato sul legando

--- Aggiustate i valori del Centro della GridBox in modo che ci sia un solo decimale e annotate i valori ottenuti (fig.9). In questo caso i valori sono
x = 12.0
y = 22.5
z = 6.0


--- Impostate le dimensioni della GridBox su 60, 60, 60 ---
Pulsante destro sulla ruota rossa x e impostate Value => 60 (punti in unità 0,375 A)
Ripetete l'operazione impostando 60 punti anche su y e su z

--- Salvate la GridBox ---
File => Close saving current (fig.10)

=== 2) Scrivere il file config.txt ==========================================

AutoDock Vina cerca nel file config.txt le informazioni minime che riguardano il docking.

receptor =....nome della proteina
ligand =...nome del legando
center_x =... coordinate del centro della GridBox
center_y =...
center_z =...

size_x =... dimensioni della GridBox in Angstrom (60 punti sono 22.5 A)
size_y =...
size_z =...
out =... nome del file in cui AutoDock Vina pone i risultati del docking

In questo caso, dunque, il file config.txt va scritto così:

receptor = p1HSG.pdbqt
ligand = MK.pdbqt
center_x = 12.0
center_y = 22.5
center_z = 6.0
size_x = 22.5
size_y = 22.5
size_z = 22.5
out = p1HSG-MK_vina.pdbqt


--- Usate copia-incolla per scrivere queste righe in Notepad o un qualsiasi editor di testo e salvate il file col nome config_p1HSG_MK.txt nella directory di lavoro C:/HIV/1HSG (vedi fig.11)

















fig. 12




fig. 13
Docking

Per fare il docking con AutoDock Vina, la directory di lavoro deve contenere i seguenti 4 file:

proteina.pdbqt
legando.pdbqt
config.txt
vina.exe


--- In questo caso verificate che in C:/HIV/1HSG siano presenti i seguenti file ---

p1HSG.pdbqt
MK.pdbqt
config_p1HSG_MK.txt
vina.exe


--- Lanciate il docking ---
Cliccate Run => Run AutoDock Vina
Si apre una finestra di dialogo.
in Vina Program Pathname cliccate => Browse => vina.exe => Apri
In Config Filename cliccate => Browse => config_p1HSG_MK.txt => Apri => Launch (fig.12)

Il processo di docking può essere più o meno lungo a seconda della potenza di calcolo del computer in uso. Con un buon computer multiprocessore questo docking richiede circa 4 minuti.
Durante il docking resta aperta la finestra di fig.13.






fig. 14
































fig.15


































fig.16


Valutare i risultati

--- Caricate il file che contiene i risultati del Docking ---
Analize => Dockings => Open Autodock Vina Results
Individuate il file con i dati del docking
=> p1HSG-MK_vina.pdbqt => Apri => Single molecule whith multiple conformations => OK
(fig.14) Il programma ha caricato una nuova molecola p1HSG_MK_vina che contiene nove diverse conformazioni calcolate da AutoDock Vina, e consente di vederle in sequenza dalla migliore (-11.6 kcal/mol) alla peggiore (-9.7 kcal/mol) premendo freccia a destra o a sinistra.

--- Togliete di mezzo, per il momento, la proteina in modo da vedere meglio il legando originale (verde) e quello calcolato da AutoDock Vina (rosa) ---
A destra di p1HSG spegnete il cerchietto L per disattivare la vista a linee. Con questo la proteina sparisce dallo schermo.
A destra di MK spegnete il cerchietto B per disattivare la vista Sticks and Balls e accendete il cerchietto L per vederlo a linee.

Ora vedrete nello schermo il legando originale MK (linee verdi) e il legando posizionato da Vina (linee rosa) con l'indicazione dell'energia di interazione proteina-legando, in questo caso -11,6 kcal/mol.

Come si vede (fig.15 e 16) la posa calcolata da AutoDock Vina si sovrappone in modo quasi perfetto al legando originale (verde) tranne che per l'anello di sinistra che appare leggermente ruotato.


--- Per capire le interazioni legando-proteina è utile osservare il legando all'interno del sito attivo ---
Togliete dalla visuale il legando originale MK e rappresentate la proteina con sfere (cerchietto C). Otterrete un'immagine tridimensionale della proteina che, se ruotata opportunamente, permette di vedere il legando immerso nel sito attivo come nella figura qui sotto. Si vedono l'anello di sinistra e quello di destra perfettamente alloggiati nelle tasche del sito attivo, inoltre si vede un gruppo NH e un gruppo OH che si avvicinano rispettivamente ad un ossigeno e ad un gruppo NH della proteina coi quali possono fare legami idrogeno.


--- Usate le potenzialità di AutoDock Tools per vedere nel dettaglio le interazioni legando-proteina ---
Analize => Macromolecule => Choose => p1HSG => Select Macromolecule
Analize => Dockings => Show interactions

Vengono mostrati solo gli amminoacidi a stretto contatto col legando. Le interazioni di van der Waals tra le porzioni apolari di legando e proteina sono mostrate con grosse sfere grigie. Le interazioni polari sono evidenziate da sfere colorate in rosso (negative) o in blu (positive), i legami idrogeno sono mostrati con file di piccole sfere verdi. Usate la finestra di dialogo (fig.18) per impostare la dimensione delle sferette verdi dei legami idrogeno su 0.13 perchè siano ben visibili.


Si notano due legami idrogeno tra il gruppo NH del legando e il carbonile della glicina 27 e tra il gruppo OH del legando e il gruppo NH dell'acido aspartico 29.
Il docking può non produrre sempre gli stessi risultati, per cui è opportuno ripeterlo più volte per confermare il risultato ottenuto.

























Fig.17


















fig.18



















Fig.19






































































































Fig.20







Docking di altri farmaci antivirali

Nella directory HIV / Proteine e legandi già pronti / Legandi
sono presenti oltre a indinavir (MK) anche
saquinavir (ROC)
ritonavir (RIT)
nelfinavir (UN)
amminimide peptide isostere (ARQ)
Provate ad eseguire il docking con questi legandi per vedere quale ha maggiore affinità per il sito di legame di HIV proteasi.



Ottimizzare il legando con Avogadro

Prima di creare nuovi legandi con Avogadro, è opportuno trattare con lo stesso programma anche il legando originale per vedere se Avogadro è affidabile.

=== 1) Ottimizzate MK con Avogadro =========

Aprite MK.pdb in Avogadro e aggiungete gli atomi di idrogeno
=> Build => Add Hydrogens for pH ... => 7.4 => OK

Ottimizzate la molecola col metodo MMFF94s
=> <E> nella barra degli strumenti => Force Field MMFF94s => Algorithm Steepest Descent => Start
Attendete che la ricerca della configurazione più stabile sia terminata (dE = 0) quindi premete => Stop
Salvate in formato pdb col nome MKA.pdb nella directory di lavoro .C:/HIV/1HSG.

Controllate con un editor di testo il file MKA.pdb appena salvato. Notate che tutti gli atomi della molecola vengono descritti così
ATOM ..1 ..N1.. MK1.. B.. 902 ..10.339 23.027 3.283 1.00 0.00 N1+
in grassetto ho posto il nome del residuo a cui appartengono, controllate che per tutti gli atomi ci sia lo stesso nome: MK1 B 902 (residuo MK1, catena B, numero del residuo 902)

=== 2) Fate il docking di MKA in p1HSG con AutoDock Vina =========

--- Preparate in AutoDock Tools il legando e salvatelo come MKA.pdbqt
Aprite MKA.pdb => Pulsante destro su All Molecules => Read Molecule => MKA.pdb => Apri.
Cliccate Ligand => Input => Choose => MKA => Select Molecule for AutoDock 4 => OK
Salvate il legando in formato pdbqt Ligand => Output => Save as PDBQT => MKA.pdbqt => Salva

--- Il file della proteina è già pronto: p1HSG.pdbqt

--- Scrivete un nuovo file config.txt che chiamerete config_p1HSG_MKA.txt che contenga il nome dei nuovi file. E' sufficiente aggiungere una A dopo MK nel vecchio file config.

receptor = p1HSG.pdbqt
ligand = MKA.pdbqt
center_x = 12.0
center_y = 22.5
center_z = 6.0
size_x = 22.5
size_y = 22.5
size_z = 22.5
out = p1HSG-MKA_vina.pdbqt


Lanciate il docking e nella finestra di dialogo cercate la posizione di vina.exe e scegliete il nuovo file config_p1HSG_MKA.txt
Alla fine esaminate i risultati => Analize => Dockings => Open Autodock Vina Results

Il legando ottimizzato con Avogadro, MKA (rosa), è quasi perfettamente sovrapposto al legando originale MK (azzurro), ma ha avuto uno score (valutazione) leggermente peggiore -11.3 kcal/mol contro le -11.6 kcal/mol ottenute da MK estratto senza modifiche da 1HSG.pdb. (fig.20)
In conclusione la conformazione di MKA calcolata da Avogadro, anche se ha dato risultati leggermente peggiori della molecola MK sperimentale, si è comportata molto bene nel docking e quindi possiamo utilizzare Avogadro per preparare nuovi farmaci.

























Fig.21




Fig.22



































Fig.23

Progettare nuovi farmaci

Per progettare una variante di indinavir, dovete esaminare il farmaco all'interno della tasca dell'enzima come si vede in figura 17.
Noterete una corrispondenza quasi perfetta in ogni punto. L'unica parte del farmaco che non interagisce al meglio sembra l'anello benzenico a sinistra in fig.17 che nella figura qui sopra si trova in alto a destra. Forse potrebbe interagire meglio con l'arginina 8 che ha di fronte e di cui si vede il gruppo NH terminale (sfera blu e bianca in alto di fig.17).

Provate ad aggiungere un gruppo OH nella posizione para dell'anello benzenico.

--- Aprite MKA.pdb in Avogadro ed eliminate gli idrogeni ---
=> Build => Remove Hydrogens

--- Aggiungete ora un atomo di ossigeno nella posizione para dell'anello benzenico ---
Cliccate sulla matita (Draw Tool) e scegliete:
Element: Oxygen
Bond Order: Single
Adjust Hydrogens Togliete la spunta
Cliccate sul carbonio para dell'anello benzenico e trascinate il mouse per creare sia l'atomo di ossigeno che il legame col carbonio para. (in alto a destra in fig.21)
Salvate il file come MKA_O.pdb

--- Fate in modo che l'atomo aggiunto da Avogadro appartenga allo stesso residuo ---
Caricate il file appena salvato in un editor di testo. Cercate l'atomo di ossigeno che avete introdotto
Lo troverete al posto 46 (fig.22), e notate che appartiene al residuo LIG 1
HETATM ...45 C ...MK1 B 902 .............5.905 23.211 3.897 1.00 0.00 C
HETATM ...46 O ...LIG ..........1 ...........19.659 19.054 9.634 1.00 0.00 O
dovete sostituire (copia-incolla) LIG... 1 con MK1 B 902 ottenendo:
HETATM ...45 C ...MK1 B 902 .............5.905 23.211 3.897 1.00 0.00 C
HETATM... 46 O ...MK1 B 902 ........ ..19.659 19.054 9.634 1.00 0.00 O
Ora tutti gli atomi di MKA_O appartengono allo stesso residuo
Salvate il file modificato col nome MKA_OO.pdb

--- Ottimizzate il legando con Avogadro ---
In Avogadro aprite MKA_OO.pdb
Aggiungete gli idrogeni => Build => Add Hydrogens for pH ... => 7.4 => OK
Ottimizzate la molecola col metodo MMFF94s
=> <E> nella barra degli strumenti => Force Field MMFF94s => Algorithm Steepest Descent => Start
Attendete che la ricerca della configurazione più stabile sia terminata (dE = 0) quindi premete => Stop
Salvate in formato pdb col nome MKA_OH.pdb nella directory di lavoro .C:/ HIV / 1HSG.

--- Fate il docking del farmaco modificato MKA_OH in p1HSG con AutoDock Vina
Preparate in AutoDock Tools il legando e salvatelo come MKA_OH.pdbqt
(Ligand Input Choose Output)
Il file della proteina è già pronto: p1HSG.pdbqt
Scrivete un nuovo file config.txt che chiamerete config_p1HSG_MKA_OH.txt che contenga i nomi dei nuovi file
Lanciate il docking e nella finestra di dialogo cercate la posizione di vina.exe e scegliete il nuovo file config_p1HSG_MKA_OH.txt
Alla fine esaminate i risultati => Analize => Dockings => Open Autodock Vina Results
Il nuovo farmaco progettato da noi MKA_OH (azzurro) ha avuto uno score migliore (-11.4 kcal/mol) di quello originale ottimizzato con Avogadro MKA (-11.3 kcal/mol).



La posizione del nuovo farmaco MKA_OH (azzurro) si è rivelata praticamente identica a quella del farmaco originale MK (verde)(fig.23). Questo significa che la modifica che abbiamo introdotto non ha disturbato la posizione del farmaco nel sito attivo.

Per valutare l'interazione del nuovo gruppo OH con l'amminoacido Arg8 rappresentiamo la proteina con sfere e MKA_OH con bastoncini come in figura 24. Si vede che il nuovo gruppo OH, sulla sinistra, si è avvicinato al gruppo NH dell'arginina 8 (al centro in alto). Probabilmente è proprio questa interazione dipolo-dipolo che ha abbassato ulteriormente l'energia del complesso proteina legando.












fig. 24










































fig. 25






































fig. 26




Nelle due figure seguenti (fig.25 e 26) si vedono i tre legami idrogeno che si sono formati tra il legando e gli amminoacidi del sito attivo
tra un OH nel centro del legando e il COOH di Asp25, .
tra l'NH del legando e il CO di Gly27
tra l'OH sul doppio anello e l'NH di Asp29.


A sinistra nella figura qui sotto (fig.26) si vede il nuovo OH che conferisce una parziale carica negativa (rossa) al legando nel punto che si affaccia sull'arginina 8.



Autore: prof Mauro Tonellato

 








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