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Chimica.it

Responsabile:
Prof. Mauro Tonellato

MODELLISTICA MOLECOLARE CON ArgusLab
10^ LEZIONE


Proteine 3
Docking molecolare
   


Lezioni con ArgusLab:
1^ 1-butene e 2-butene
2^ Carbocatione 1° e 2°
3^ Acetone e tautomeria
4^ Dieni coniugati pdf
5^ Benzene e aromaticità pdf
6^ Legame covalente
7^ Conformazione alcani
8^ Struttura delle proteine
9^ Legandi e Siti di legame
10^ Docking molecolare
11^ Ponte Cloronio
12^ Diels-Alder

Chimica al Computer


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Per seguire questa lezione dovete avere già visto la 1^ e la 2^ lezione di modellistica molecolare con ArgusLab nelle quali sono state spiegate le procedure di base che qui verranno date per conosciute.
Questa lezione può essere svolta in due modi
1) Online. Potete leggere le istruzioni, eseguire l'esercizio con ArgusLab, usare le illustrazioni per vedere quel che dovreste ottenere.
2) In aula informatica con la classe. Se siete insegnanti di chimica, potete adattare la lezione alle esigenze della vostra classe e poi riproporla in aula informatica ai vostri allievi. La durata della lezione è di circa due ore.
N.B. Cliccando sulle immagini potrete vederle a pieno schermo!

Gli argomenti di questa lezione sono:
-- Docking 1: riposizionamento del legando originale nel sito di legame
-- Docking 2: posizionamento di un legando diverso

Docking
Per docking (dall'inglese andare in porto) si intende l'inserimento di un legando nel sito di legame di una proteina in un'operazione simulata al computer di modellistica molecolare. Permette di prevedere se un certo legando è in grado di legarsi nel sito attivo di un enzima.

Recentemente lo studio del docking al computer si è molto diffuso nella ricerca farmacologica perchè permette di individuare, tra le centinaia di molecole possibili, quelle che sono in grado di legarsi in modo più efficiente nel sito di legame di una proteina e quindi quelle che possono diventare un farmaco in grado di bloccare l'azione di quella particolare proteina. In questo modo i chimici possono evitare di sintetizzare centinaia di molecole inutili e preparare solo su quelle che si sono rivelate più promettenti nel docking. Queste vengono poi testate in laboratorio per misurare la loro reale affinità per l'enzima in questione. Le indicazioni di affinità enzimatica servono al chimico di modellistica molecolare per ottimizzare il suo modello al computer e studiare altre varianti della molecola legando. Questa procedura viene ripetuta più e più volte in un processo iterativo che vede la collaborazione di gruppi di ricerca diversi (modellistica molecolare, sintesi chimica, affinità enzimatica) e permette di arrivare ad ottenere nuovi farmaci in modo più mirato, senza procedere a caso come si faceva in passato.
Questo nuovo approccio è chiamato progettazione razionale del farmaco.

Arguslab è un programma di modellistica molecolare che consente di eseguire il docking!
In questa prima esperienza di docking proverete a riposizionare nel sito di legame lo stesso legando che è già presente nella proteina. Potrete confrontare la posizione del legando calcolata da Arguslab con quella sperimentale ottenuta dall'analisi ai raggi X della proteina.


Recettore dell'acetilcolina
Anche in questa terza lezione sulle proteine, studierete il recettore dell'acetilcolina, ma, invece della proteina completa (fig.1), ne userete solo un frammento, 1uv6_tut (fig.2), che avete già usato nelle due lezioni precedenti. Questa struttura contiene solo 2 delle 5 catene proteiche che la molecola possiede in natura. Al posto dell'acetilcolina, in questa struttura è presente un suo analogo, la carbammilcolina, una molecola modificata che si lega nella proteina in modo più stabile e può essere cristallizzata più facilmente.

Prima di cominciare, scaricate il file 1uv6_tut.zip, decomprimetelo per ottenere il file PDB 1uv6_tut.pdb e collocatelo in una directory chiamata Acetilcolina.



fig. 1



fig. 2

Individuare il Legando
Nella proteina recettore dell'acetilcolina, 1uv6_tut, vi è un legando, carbammilcolina, all'interno del sito di legame. Per individuarlo, aprite il file PDB 1uv6_tut con ArgusLab, facendo attenzione a selezionare il tipo corretto di file nella finestra di dialogo:
File / Open / Tipo di File
(Brookhaven PDB files).

Assicuratevi che sia selezionata la vista ad albero della molecola: Tools / Molecule Tree View
oppure cliccate il pulsante nella barra degli strumenti.

Nella finestra con la vista ad albero seguite il percorso 1uv6_tut / Residues / Misc
qui si trova il legando 1206 CCE (carbammilcolina) cliccatelo per selezionarlo,
poi scegliete Edit / Hide Unselected e poi
click destro
(su 1206 CCE) / Set Render Mode / Cylinder med , infine
View / Center molecule view in window
oppure cliccate il pulsante nella barra degli strumenti.
Ora fate click destro (su 1206 CCE) e scegliete Make a Ligand Group from this Residue (fig. 3)


fig. 3

Nella directory Groups ora compare un nuovo legando 1 CCE
fate click destro su questo e scegliete Modify Group, nella finestra che compare cambiategli il nome in CCE raggi X, per ricordarvi che questo è il legando originale ottenuto con la diffrazione ai raggi X.
Selezionatelo con un click e aggiungete gli idrogeni con Shift + pulsante H nella barra degli strumenti (add hydrogens).
Il legando carbammilcolina è ora perfettamente leggibile come in figura 4.













































fig. 4



Individuare il Sito di Legame
Fate un click destro su 1 CCE raggi X e selezionate Make a BindingSite Group for this Group e ArgusLab mostrerà gli amminoacidi che circondano il legando.
Nella directory Groups compare un nuovo gruppo 2 CCE raggi X bindingsite.
Gli amminoacidi del sito di legame formano le pareti della cavità nella quale è contenuto il legando all'interno della proteina (figura 5).


fig. 5




Creare un nuovo Legando
Selezionate il legando 1 CCE raggi X con un click, poi premete Ctrl + c per copiarlo e Ctrl + v per incollarlo. Il nuovo legando compare all'interno di una sfera di riposizionamento, potete ruotarlo col mouse o trascinarlo con Shift + mouse o Ctrl + mouse. Quando si trova nel punto desiderato (vicino al primo legando) fate un click in un punto casuale della finestra per stabilizzarlo.
Nella directory Misc è comparso il nuovo legando 1230 CCE.
Fate Click destro (su 1230 CCE) e scegliete Make a Ligand Group from this Residue.
Nella directory Groups ora compare il nuovo legando 3 CCE.
Fate click destro (su 3 CCE) / Set Render Mode / BallCylinder med.
Fate ancora click destro su questo e scegliete Modify Group e nella finestra che compare cambiategli il nome in CCE Carbammilcolina (figura 6).


fig. 6






































Calcolare il Docking
Ora avete il legando originale 1 CCE raggi X,
il legando da posizionare 3 CCE carbammilcolina,
il sito di legame 2 CCE raggi X bindingsite.
E' venuto il momento di procedere col Docking.
Scegliete Calculation / Dock a Ligand oppure cliccate il pulsante , nella finestra che compare scegliete il giusto legando 3 CCE carbammilcolina, il sito di legame è già individuato, scegliete Calculate Size per definire le dimensioni dello spazio assegnato al sito di legame (figura 7).


Fig. 7

Cliccate, in questa finestra, le opzioni avanzate Advanced... e scegliete High Precision, quindi premete OK e poi Start.
Iniziano i calcoli del Docking e il programma cerca la posizione nella quale il legando assume la posizione più conveniente che porta ad un minimo di energia. In questo caso Arguslab ha calcolato una posizione che produce un guadagno energetico di 6,14 kcal / mol:
DG = -6,14 kcal / mol.






























Valutare il Docking

Potete valutare la bontà del docking appena eseguito confrontando la posizione del legando, calcolata da Arguslab, con quella determinata sperimentalmente con la diffrazione ai raggi X. Questo confronto può essere fatto da voi stessi osservando la posizione dei due legandi nella finestra, ma può anche essere valutata matematicamente dal programma come scarto quadratico medio tra le posizioni di atomi corrispondenti nelle due molecole.

Selezionate con un click il legando originale 1 CCE raggi X nella finestra ad albero,
poi selezionate anche il legando riposizionato 3 CCE Carbammilcolina con Ctrl + click.
Quando i due legandi sono entrambi selezionati, fate click destro sulla directory Groups e scegliete Calculate RMSD position between two similar Groups
(figura 9).


fig. 9

Naturalmente, più piccolo è lo scarto quadratico medio più vicino è il nuovo legando al legando originale, in questo caso si sono ottenuti 0,82 A.












fig. 10



















Docking con Acetilcolina
Provate ora ad effettuare il docking con un legando diverso da quello originale. Utilizzate l'acetilcolina, il legando che naturalmente si lega a questo recettore. Scaricate il file acetilcolina.zip, decomprimetelo per ottenere il file PDB acetilcolina.pdb e collocatelo nella directory chiamata Acetilcolina.

Caricate l'acetilcolina con File / Open / acetilcolina.pdb. Nella finestra ad albero trovate una nuova directory Acetilcolina, in questa cercate Residues / Misc / 1 DEF ,
Fate Click destro (su 1 DEF) e scegliete Make a Ligand Group from this Residue.
Nella directory Groups ora compare il nuovo legando 4 DEF.
Fate click destro (su 4 DEF) e quindi scegliete Set Render Mode / Cylinder med(figura 10).
Fate ancora click destro su questo e scegliete Modify Group e nella finestra che compare cambiate il nome in Acetilcolina.
Ora fate click destro su 1 CCE raggi X e scegliete Hide in modo che sia visibile solo il legando Carbammilcolina appena riposizionato col docking precedente.
Siete pronti ore per anciare i calcoli di un nuovo docking usando come legando Acetilcolina:
cliccate il pulsante e, nella finestra che compare, scegliete il legando Acetilcolina, il sito di legame è già individuato, scegliete Calculate Size per definire le dimensioni dello spazio assegnato al sito di legame infine cliccate Advanced... e scegliete High Precision, quindi premete OK e poi Start.
(figura 11).


fig. 11

Notate la straordinaria vicinanza delle due molecole: sia Carbammilcolina (gialla in figura) che Acetilcolina (rappresentata con cilindri colorati) hanno assunto nel sito di legame posizioni sovrapponibili. Il DG del Docking dell'acetilcolina è quasi identico al precedente
DG = -6,03 Kcal / mol.

Valutate, infine, i legami idrogeno con cui il legando interagisce con il sito di legame.
Fate Click destro su 5 Acetilcolina e quindi scegliete Show hydrogen bonds. Notate che il programma considera soprattutto l'interazione dei due ossigeni dell'acetilcolina con il ponte disolfuro e con l'OH di una tirosina (fig 12).


fig. 12

Autore: prof Mauro Tonellato

 








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